[发明专利]一种外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法及其穿梭质粒

摘要

一种外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，在厌氧环境，温度控制在37℃的条件下，包括制备启动子、穿梭质粒的构建以及空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型的建立的步骤。本发明通过电转化转入空肠弯曲杆菌ATCC33291和ATCC35921在卡那霉素抗生素的选择压下表达，无需添加任何底物可以观测到生物冷光，直观表达生物信息，具有广阔的研究前景。

主权项

一种外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：以下步骤的实施条件均为厌氧环境，温度控制在37℃；1)制备启动子a.使用试剂盒分离纯化空肠弯曲杆菌DNA；b.对得到的空肠弯曲杆菌DNA，通过PCR克隆空肠弯曲杆菌flaA基因的启动子σ28NC_002163；2)穿梭质粒的构建a.用双酶切已克隆的启动子，同时用同样的方法酶切质粒pRY107，并去磷酸化处理防止自连；b.用连接酶连接(T4DNA连接酶)，温度控制在16℃，反应20～24h，将克隆的空肠弯曲杆菌flaA基因的启动子σ28NC_002163与无启动子且含来自无色杆菌的luxCDABE基因全序列质粒pRY107融合，构建融合质粒载体pRY107luxCDABE；c.将构建的质粒通过电转化转入大肠杆菌，以抗生素卡那霉素(kana)为选择压，筛选转化体，并得到可发出生物冷光的转化体；3)空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型的建立a.将构建好的质粒载体pRY107luxCDABE利用电转化转入大肠杆菌，扩大后用质粒提取试剂盒，提取质粒并纯化；b.再通过电转化将构建的质粒载体pRY107luxCDABE转入空肠弯曲菌中并表达，形成空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型，完成外源性基因lux在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建。