[发明专利]一种外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法及其穿梭质粒

说明书

技术领域

本发明涉及一种外源性基因表达系统的构建方法及其穿梭质粒，具体涉及一种外源性基因(Lux)在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法及其穿梭质粒。

背景技术

近几年来基因重组技术得到了迅速的发展，人们已经能将具有某种功能的基因连接到适当的载体上并通过化学或物理的方法转化到细菌或植物、动物细胞中，这一技术已经应用于制造外源蛋白质产品，器官移植，动、植物转基因育种、基因治疗、生物感应器等方面有广阔的应用前景。

如今，人们利用外源基因表达技术生产生物传感器，和传统检测方法不同，新的生物传感器是将编码某种发光物质的外援基因(DNA或RNA)直接倒入某种微生物体内，并通过宿主细胞的表达系统合成外源性基因代谢产物，通过理化检测代谢产物的合成数量以达到无害快速检测监测的目的。Lux基因是编码和调控发光细菌生物发光的操纵子，其中主要有五个基因(Lux ABCDE)共同存在于所有的发光细菌中，并以lux CDABE顺序排列，分别编码不同的功能亚单位。Lux报告基因生物发光检测系统，是用荧光素酶(Lux)基因标记细胞或DNA，利用光学检测仪器，研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展变化、特定基因的表达等生物学过程。然而传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物或破碎细胞以获得数据，得到多个时间点的实验结果。相比之下，该技术通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化，所得的数据更加真实可信。另外，这一技术因其操作简单、不涉及放射性物质、所得结果直观、灵敏度高等特点，近年来在医学研究及药物开发、高产量药物的筛选、基因治疗实验、以及在生物传感器的构建中发挥着其独特的功能。

1989年PARK，S.F.和STIRLING，D.A.第一个成功的将Lux基因用作生物发光报告基因应用于检测大肠杆菌Escherichia Coli K12功能基因表达以来，引起了人们的广泛关注。由于Lux报告基因生物发光技术在使用中具备以下特点：(1)由原核基因编码的基因产物与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；(2)细胞内其它基因产物不会干扰报告基因产物的检测；(3)编码产物的检测快速、简便、灵敏度高而且重现性好。目前，Lux报告基因生物发光技术已经被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具，以其独特的优势，被广泛地应用于病毒学研究、食源性有害微生物快速检测、构建转基因微生物及动物模型、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究以及细胞体外检测等领域。

但是，迄今为止，国内外尚未将见将Lux报告基因生物发光技术应用于空肠弯曲杆菌研究领域的报道。本专利依据Lux报告基因生物发光技术的不丢失细胞活性，不破坏细胞膜、快速、灵敏、易于检测的生物学特点，将Lux报告基因生物发光技术引入到空肠弯曲杆菌的研究领域，通过建立稳定、灵敏、强发光可用于动物活体检测的空肠弯曲杆菌发光模型，进一步利用Lux报告基因在分子水平研究空肠弯曲杆菌。相信它的成功将为深入研究空肠弯曲杆菌的生物学特性及致病机理提供坚实的理论基础和全新的方法途径。

Lux基因生物传感器发展的制约因素是如何将外源发光基因Lux在表达系统中高效表达，即如何建立外源基因的高效表达系统，所谓外源基因是指生物体正常基因中原来不存在的外来的基因，细胞可以通过基因操作技术来获得外源基因。外源基因表达系统近几年得到了迅速的发展，被认为是最具有发展前景的生产功能蛋白质及建立生物传感器的重要工具之一，外源性Lux基因表达主要分为下列步骤：

1.目的基因(Lux)的选择、克隆和加工

基因由于具有某种功能而被利用，即成为目的基因，目的基因的选择至关重要。构建生物发光传感器时，通常是选择Lux及gfp基因作为目的基因，因为检测方便，最好是选择可进行活体检测的Lux基因。基因按照其顺序一次分为几部分：启动子，编码序列，终止序列。所述的目的基因为某一种生物的基因，由于其在此种生物的体内的表达量很低，或者由于此种生物缺乏而不能满足人类的需要，所以将目的基因克隆出来，去掉目的基因的天然启动子，将强启动子序列和目的基因合并成融合基因。

2.目的基因(Lux)和载体的结合