[发明专利]一种外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法及其穿梭质粒

权利要求书

1.一种外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：

以下步骤的实施条件均为厌氧环境，温度控制在37℃；

1)制备启动子

a.使用试剂盒分离纯化空肠弯曲杆菌DNA；

b.对得到的空肠弯曲杆菌DNA，通过PCR克隆空肠弯曲杆菌flaA基因的启动子σ28NC_002163；

2)穿梭质粒的构建

a.用双酶切已克隆的启动子，同时用同样的方法酶切质粒pRY107，并去磷酸化处理防止自连；

b.用连接酶连接(T4DNA连接酶)，温度控制在16℃，反应20～24h，将克隆的空肠弯曲杆菌flaA基因的启动子σ28NC_002163与无启动子且含来自无色杆菌的luxCDABE基因全序列质粒pRY107融合，构建融合质粒载体pRY107luxCDABE；

c.将构建的质粒通过电转化转入大肠杆菌，以抗生素卡那霉素(kana)为选择压，筛选转化体，并得到可发出生物冷光的转化体；

3)空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型的建立

a.将构建好的质粒载体pRY107luxCDABE利用电转化转入大肠杆菌，扩大后用质粒提取试剂盒，提取质粒并纯化；

b.再通过电转化将构建的质粒载体pRY107luxCDABE转入空肠弯曲菌中并表达，形成空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型，完成外源性基因lux在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建。

2.根据权利要求1所述外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于，通过PCR克隆空肠弯曲杆菌flaA基因的启动子σ28NC_002163，具体的引物和PCR过程如下：

上游5’-ACGCGAATTCAATATTTACCAAAAACTTTAACAACC-3’

下游5’-ACGCGTCGACTCCTTTAAATAATTTCAAACTCATCCAT-3’

94℃4min

94℃变性反应1min

49℃退火反应1min

72℃延伸反应1min

经过4个循环

94℃变性反应1min

59℃退火反应1min

72℃延伸反应1min

经过25个循环

72℃7min结束。

3.根据权利要求1所述外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于，所述电转化具体是：将感受态空肠弯曲杆菌同纯化质粒转入预冷的0.2cm的电击杯中，并轻敲电击杯，使混合物沉入电击杯底，在电转化仪上进行转化，其条件为电压2.5kV/cm-1、电容25μF、电阻200欧。

4.根据权利要求1所述外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于：所述空肠弯曲杆菌是指空肠弯曲杆菌ATCC33291和空肠弯曲杆菌ATCC35921。

5.根据权利要求1所述外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5α。

6.根据权利要求1～5任一所述外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于：所述酶切时的酶是限制性内切酶Sall和EcoR1。

7.根据权利要求6所述外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于：所述连接酶是指T4DNA连接酶。

8.根据权利要求7所述外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于：所述厌氧环境是指体积百分含量在5％氧气以及10％二氧化碳的厌氧环境。

9.一种按权利要求1方法得到的穿梭质粒pRY107LuxCDABE，其特征在于：该穿梭质粒pRY107LuxCDABE包括大肠杆菌和空肠弯曲杆菌的复制区，从无色杆菌克隆的报告基因luxCDABE的全序列以及空肠弯曲杆菌致病基因flaA启动子。

10.根据权利要求9所述穿梭质粒pRY107LuxCDABE，其特征在于：所述空肠弯曲杆菌致病基因flaA启动子和报告基因luxCDABE直接相连。