[发明专利]粒状聚(N－异丙基丙烯酰胺－丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法

摘要

本发明公开了一种用粒状聚(N－异丙基丙烯酰胺－丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法，具体步骤如下：1)反相悬浮聚合法制备粒状聚(N－异丙基丙烯酰胺－丙烯酸钠)共聚凝胶；2)粒状聚(N－异丙基丙烯酰胺－丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性。本发明所开发的粒状聚(N－异丙基丙烯酰胺－丙烯酸钠)共聚凝胶，作为一种新型的蛋白质体外复性添加剂，具有以下优点：①在高变性蛋白浓度条件下可显著提高目标蛋白的活力回收率；②复性完成后可利用凝胶的温敏特性方便地分离回收，凝胶可重复利用；③可以通过控制共单体丙烯酸钠的含量来调节凝胶的疏水性能，改变低临界溶解温度和最大溶胀倍率，使其适用于不同的目标蛋白。因而该凝胶在蛋白质复性领域具有较好的应用前景。

主权项

1.一种粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺—丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于方法的步骤如下：1)取40～60mL浓度为0.2～0.4mol/L的NaOH溶液，加入过量的丙烯酸水溶液，搅拌反应4～6h后，减压蒸发除去溶剂及残余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸钠固体；2)将表面活性剂吐温-80溶于75～100mL有机相液体石蜡中，使其浓度为1～1.5％(g/mL)，加入反应器，通入氮气，搅拌20～30min，使表面活性剂充分分散，然后将体积为有机相体积1/3的含有各种反应组分的原料水溶液用移液枪缓慢滴加入反应器中，原料水溶液组成为：质量百分比浓度为14％(g/g)的主单体、交联度为10％(g/g)、单体N-异丙基丙烯酰胺与共单体丙烯酸钠的摩尔比为19:1～9:1、浓度为0.5～0.8％(g/mL)的氧化剂过硫酸铵，在氮气保护下，搅拌30～40min后，缓慢加入引发剂N，N，N’，N’-四甲基乙二胺2～3μL，聚合温度控制在20～25℃，搅拌速度控制在250～280rpm，反应3～4h出料，产物用无水乙醇/水反复浸泡洗涤，于真空干燥箱中烘干，即可得到粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺—丙烯酸钠)共聚凝胶；其中，主单体包括单体N-异丙基丙烯酰胺与交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，交联度是指交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺在主单体中所占的质量百分比；3)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100～120rpm摇床中处理90～120min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.1～0.5mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入复性缓冲液，混匀，得到10mL复性体系溶液；4)在复性体系溶液中加入粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺—丙烯酸钠)共聚凝胶，凝胶质量浓度为复性体系溶液中溶菌酶质量浓度的160～560倍，溶液在温度为20～40℃、转速为100～140rpm的摇床中复性16～24h。