[发明专利]粒状聚(N－异丙基丙烯酰胺－丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法

权利要求书

1.一种粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于方法的步骤如下：

1)取40～60mL浓度为0.2～0.4mol/L的NaOH溶液，加入过量的丙烯酸水溶液，搅拌反应4～6h后，减压蒸发除去溶剂及残余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸钠固体；

2)将表面活性剂吐温-80溶于75～100mL有机相液体石蜡中，使其浓度为1～1.5％g/mL，加入反应器，通入氮气，搅拌20～30min，使表面活性剂充分分散，然后将体积为有机相体积1/3的含有各种反应组分的原料水溶液用移液枪缓慢滴加入反应器中，原料水溶液组成为：质量百分比浓度为14％g/g的主单体、交联度为10％g/g、单体N-异丙基丙烯酰胺与共单体丙烯酸钠的摩尔比为19∶1～9∶1、浓度为0.5～0.8％g/mL的氧化剂过硫酸铵以及去离子水，在氮气保护下，搅拌30～40min后，缓慢加入引发剂N，N，N’，N’-四甲基乙二胺2～3μL，聚合温度控制在20～25℃，搅拌速度控制在250～280rpm，反应3～4h出料，产物用无水乙醇/水反复浸泡洗涤，于真空干燥箱中烘干，即可得到粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸钠)共聚凝胶；其中，主单体为单体N-异丙基丙烯酰胺与交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，交联度是指交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺在主单体中所占的质量百分比；

3)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100～120rpm摇床中处理90～120min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.1～0.5mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入复性缓冲液，混匀，得到10mL复性体系溶液；

4)在复性体系溶液中加入粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸钠)共聚凝胶，凝胶质量浓度为复性体系溶液中溶菌酶质量浓度的160～560倍，溶液在温度为20～40℃、转速为100～140rpm的摇床中复性16～24h；

所述的变性缓冲液含有8mol/L尿素、1mmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5；

所述的复性缓冲液含有1mmol/L乙二胺四乙酸钠、3mol/L尿素、0.15mol/L氯化钠、3mmol/L还原型谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化型谷胱甘肽的0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。

2.根据权利要求1所述的一种粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于所述的N-异丙基丙烯酰胺采用正己烷重结晶。

3.根据权利要求1所述的一种粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于所述凝胶在溶菌酶复性完成后可通过升高温度至凝胶相变温度之上，使凝胶缩水从而排出凝胶网格中的蛋白溶液，再进行离心过滤即可将凝胶从复性液中分离回收，重复使用。