[发明专利]粒状聚(N－异丙基丙烯酰胺－丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺—丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法。

背景技术

基因工程技术是现代生物技术的主体，其迅猛发展使得蛋白质的异体表达成为发展生物医药工业和获得特殊化学品的重要途径。但是在基因工程蛋白质产业化过程中往往面临这样一个难题：重组表达产物通常是以无生物活性的包涵体形式存在的。如何使包涵体高效地重折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，是决定该基因工程蛋白质能否产业化和为人类所利用的关键，因而蛋白质体外复性技术领域成为近年来的研究热点之一。但由于蛋白质本身的多样性、结构和折叠过程的复杂性，使得人们不能简单地把一种复性方法移植到多种蛋白质复性体系中，也很难找到具有普适性而又低成本的高效复性方法。因此实际操作过程中必须针对每种目标蛋白质的特点，对影响复性的各个因素逐一优化，才能最终确定适用于该种蛋白质的复性方法。

到目前为止，蛋白质复性过程中的许多问题依然困扰着人们，如活性回收率较低、复性起始和终了的蛋白质浓度偏低以及后处理过程繁琐等。随着研究的深入，开发了一些能够在高浓度条件下协助蛋白质进行体外复性的方法，主要有：色谱复性，该方法复性回收率高、操作简便快速，但往往因为设备及材料投入成本高而影响了其在工业生产中的大规模应用；分子伴侣和折叠酶介导的蛋白质复性，该方法是受到体内蛋白质折叠过程的启发，能够在一定程度上提高复性收率，但是其来源有限，购买价格昂贵，即使通过微生物发酵自行制备，也会存在发酵成本较高且产品易失活等问题，一般仅用于复性机理的研究；常规的蛋白质复性添加剂如聚乙二醇、L-精氨酸、去污剂和表面活性剂以及人工分子伴侣等，虽然对设备要求不高，但协助复性效果有限，且复性过程完成后难以与目标蛋白质进行分离。在这种情况下，开发出一种新型、高效、易于分离回收而又低成本的蛋白质体外复性添加剂就显得尤为重要。近年来随着交叉学科的迅速发展，智能型聚合物作为一种新型的蛋白质体外复性添加剂越来越引起人们的重视，其主要优点在于影响复性过程的参数较少、操作方便、仪器设备要求较低且易于分离回收。

本课题组合成了各种分子量的线性聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)聚合物并将其应用于溶菌酶体外复性过程(参见线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法，发明专利申请号：200810062428.3)，结果表明分子量适中的PNIPAAm聚合物协助溶菌酶复性的效果很好，在蛋白浓度为600μg/mL时，PNIPAAm的加入使酶的活性回收率从稀释复性的10％提高到80％左右。但是采用线性聚合物作为复性添加剂，复性完成后需先通过加热的方式使PNIPAAm从水溶液中析出，再经过一步高速离心才能实现复性后目标蛋白质与PNIPAAm水溶性聚合物的分离，操作相对麻烦；另外由于该聚合物的聚合度不易控制，一方面会导致其协助复性效果有较大的波动，另一方面那些聚合度较小的PNIPAAm分子由于和复性液中目标蛋白的分子量差别不大而难以通过离心完全除去。本课题组还曾合成了粒状聚N-异丙基丙烯酰胺并考察其协助溶菌酶复性的效果(参见温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法，发明专利申请号：ZL200410073406.9，授权日：2006年8月2日)，该聚合物是一种交联网络状凝胶，在水中可以显著溶胀，但不能溶解。由于该凝胶具有线性PNIPAAm聚合物所拥有的疏水特性，从而可以起到协助蛋白质体外复性的作用；且复性过程结束后可利用其温度响应特性，通过在溶液中反复溶胀(低于其临界溶解温度LCST)和缩水(高于LCST)的方法使凝胶快速地分离、回收并重复使用。但是该粒状凝胶的机械强度较弱，且相变温度的可调范围较窄，从而使其应用受到了限制。本发明在前期工作的基础上，通过在聚合过程中引入共单体丙烯酸钠(SA)，制备得到粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺—丙烯酸钠)共聚凝胶。一方面，该共聚凝胶具有疏水基团异丙基，可以通过疏水相互作用来抑制变性蛋白及其折叠中间体因相互聚集而导致的沉淀，从而协助蛋白质复性；另一方面，共聚单体SA的引入使得凝胶的机械强度明显增强，从而显著地提高其吸水能力，大大增加了凝胶的最大溶胀倍率；最后，共聚单体SA的引入使得该凝胶的相变温度有所上升，且可通过改变SA的加入量方便地调节其相变温度，以适用于不同的目标蛋白。

发明内容

本发明的目的是在克服现有技术不足，提供一种粒状聚(N-异丙基丙烯酰胺—丙烯酸钠)共聚凝胶协助溶菌酶体外复性的方法。

方法的步骤如下：