[发明专利]一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法

摘要

本发明为一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法，属于生物技术领域。利用农杆菌介导法进行苏丹草外源基因转化时，以苏丹草幼穗离体培养诱导的淡黄色颗粒状愈伤组织为受体材料，经农杆菌感染和共培养，在附加抗生素500mg/L的羧苄青霉素的继代培养基中，经10～20mg/L卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织转入附加抗生素500mg/L的羧苄青霉素的分化培养基中获得再生植株，壮苗、生根培养、移栽成活后经PCR检测，获得了转基因植株。本发明建立的苏丹草遗传转化方法，转化效率达到3％以上，为应用农杆菌介导法进行多用途苏丹草转基因育种奠定基础。

主权项

1、一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法，其特征在于，(1)以幼穗为材料诱导的颗粒状愈伤组织为受体材料取苏丹草1～5cm长的幼穗，在无菌条件下用体积比70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外的叶鞘，剥出幼穗并切成2～3mm段，把幼穗切段接种在愈伤组织诱导培养基上，培养室温度为26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养，20～25d后获得白色或淡黄色、颗粒状愈伤组织，选用淡黄色颗粒状愈伤组织为受体材料；(2)愈伤组织诱导、继代和分化培养基基本培养基：MS大量元素、MS微量元素、B5有机成分，活性碳0.05％，蔗糖3％，琼脂条的用量为0.8％；愈伤组织诱导培养基和继代培养基SI：基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D3mg/L和激动素KT 0.2mg/L；绿苗分化培养基SD：基本培养基附加6-苄基氨基嘌呤6-BA 2mg/L和萘乙酸NAA0.01mg/L；壮苗、生根培养基SR：基本培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 2mg/L和萘乙酸NAA 0.01mg/L培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；(3)农杆菌转化和共培养将携带质粒的农杆菌菌液1mL从-70℃的冰箱中取出后，接种到5mLYEB液体培养基中，26℃、200rpm振荡培养24h进行活化，再取活化液1mL接种到50mL YEB液体培养基中，继续振荡培养6h至OD600约0.6，用无菌蒸馏水将菌液稀释至OD600约为0.3，加入终浓度为100μM的乙酰丁香酮AS，继续振荡培养2h，将淡黄色颗粒状愈伤组织在农杆菌菌液中浸泡2min，用无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸去多余菌液后接种于愈伤组织继代培养基上培养20～24h；(4)卡那霉素抗性愈伤组织的筛选经农杆菌转化和共培养的淡黄色颗粒状愈伤组织，当观察到愈伤组织周围培养基上出现农杆菌菌落时，转入含500mg/L羧苄青霉素的愈伤组织继代培养基，经10-20mg/L卡那霉素抗性筛选，获得具有卡那霉素抗性的愈伤组织；(5)卡那霉素抗性愈伤组织的分化将经卡那霉素抗性筛选的颗粒状愈伤组织，转入含500mg/L羧苄青霉素的分化培养基中，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养30～40d；(6)抗性苗的壮苗、生根培养把具有3片以上叶的抗性苗，转入壮苗、生根培养基SR：MS基本培养基+CPPU2.00mg/L+NAA 0.01mg/L，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养30～40d至幼苗高度为5cm以上；(7)抗性苗的移栽及分子检测去掉封口的棉花塞，加自来水，以水面略高于培养基为宜，冬季在18～25℃的智能温室炼苗2d后，用自来水冲洗干净再生植株根部所带的培养基，移栽至装有大田土壤的塑料盆中；取移栽成活、综合农艺性状优良的植株幼嫩叶片，提取DNA并进行PCR检测，获得含有目标基因的转化植株；(8)目的基因表达的转基因植株的获得对含有目标基因的转化植株，进行目标性状鉴定，获得目标基因表达的转基因植株。