[发明专利]一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法，属于基因工程利用技术领域。

二、技术背景

苏丹草(Sorghum sudanense)为高粱属一年生禾本科牧草，可青饲、青贮和调制干草，为各类草食畜禽及草食性鱼类所喜食。苏丹草世界各地均有种植，中国南至海南，北至内蒙古均能栽培，是长江中下游地区最主要的暖季型牧草，占该区域暖季型牧草种植面积的70％以上，同时苏丹草作为生物质能源作物近年来正在日益受到重视。而南方农区人多地少、人畜争地争粮矛盾突出，充分利用大面积的盐渍土发展牧草种植，是当前草食畜禽养殖业中急需解决的问题。已有研究表明：苏丹草在1‰的滨海盐渍土壤上出苗并正常发育，＞2‰生长受抑制，产草量明显下降。

同时叶斑病是苏丹草种植区普遍发生的病害。我国长江中下游地区由于高温高湿气候的影响，特别在7～9月养殖业需草高峰期，叶斑病发生尤为严重，致使供青期缩短、饲草品质和产草量下降。每亩鲜草减产量在500～1000公斤以上，以每公斤鲜草0.08元计，每年仅此一项，长江中下游地区损失纯利润达4000万元～8000万元。苏丹草叶斑病目前尚无特效药物防治。

采用常规技术选育苏丹草耐盐和抗病品种不仅周期长，工作量大，而且由于缺乏近缘耐盐和抗病材料，苏丹草抗性育种进展缓慢。植物基因工程是在基因水平上定向改造植物的遗传物质，可打破物种之间的生殖隔离障碍，提高育种的目的性和可操作性，已成为现代育种的重要途径。在各种植物转基因方法中，由于农杆菌介导法具有易操作、低费用、高效率、插入片段确定性好和转基因拷贝数低等独特优点，已成为转基因策略中的首选方法。但由于苏丹草为高粱属牧草，与其它作物相比，通过组织培养获得高频再生植株相对更难一些，苏丹草农杆菌介导法转基因育种国内尚未见正式报道。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于提供一种利用农杆菌介导基因转化苏丹草的技术体系，该方法能够使苏丹草颗粒状愈伤组织基因转化效率达到大于1％的实用化程度，为采用转基因方法对多用途苏丹草进行遗传改良提供研究基础和技术支撑。

技术方案

1、一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法，其特征在于：

(1)以幼穗为材料诱导颗粒状愈伤组织为受体材料

取苏丹草1～5cm长的幼穗，在无菌条件下用70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外的叶鞘，剥出幼穗并切成2～3mm段，把幼穗切段接种在愈伤组织诱导培养基上，培养室温度为26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养，20～25d后获得白色或淡黄色、颗粒状愈伤组织，选用淡黄色、疏松的颗粒状愈伤组织为受体材料；

(2)愈伤组织诱导、继代和分化培养基

基本培养基：MS大量元素、MS微量元素、B₅有机成分，活性碳0.05％，蔗糖3％，琼脂条的用量为0.8％；

愈伤组织诱导培养基和继代培养基(SI)：基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸3mg/L和激动素0.2mg/L；

绿苗分化培养基(SD)：基本培养基附加6-苄基氨基嘌呤2mg/L和NAA 0.01mg/L；

培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；

(3)农杆菌感染和共培养

将携带质粒的农杆菌菌液1mL从-70℃的冰箱中取出后，接种到5mLYEB液体培养基中，26℃、200rpm振荡培养24h进行活化，再取活化液1mL接种到50mL YEB液体培养基中，继续振荡培养6h至OD₆₀₀约0.6，用无菌蒸馏水将菌液稀释至OD₆₀₀约为0.3，加入终浓度为100μM的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，继续振荡培养2h，将淡黄色颗粒状愈伤组织在农杆菌菌液中浸泡2min，用无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸去多余菌液后接种于愈伤组织继代培养基上培养20～24h。

(4)卡那霉素抗性愈伤组织的筛选

经农杆菌感染和共培养的淡黄色颗粒状愈伤组织，当观察到愈伤组织周围培养基上出现农杆菌菌落时，转入含500mg/L羧苄青霉素的愈伤组织继代培养基，经10-20mg/L卡那霉素抗性筛选，获得抗性愈伤组织。

(5)卡那霉素抗性愈伤组织的分化

将经卡那霉素抗性筛选的颗粒状愈伤组织，转入含500mg/L羧苄青霉素的分化培养基中，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养30～40d。

(6)再生转化苗的壮根培养