[发明专利]一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法，其特征在于，

(1)以幼穗为材料诱导的颗粒状愈伤组织为受体材料

取苏丹草1～5cm长的幼穗，在无菌条件下用体积比70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外的叶鞘，剥出幼穗并切成2～3mm段，把幼穗切段接种在愈伤组织诱导培养基上，培养室温度为26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养，20～25d后获得白色或淡黄色、颗粒状愈伤组织，选用淡黄色颗粒状愈伤组织为受体材料；

(2)愈伤组织诱导、继代和分化培养基

基本培养基：MS大量元素、MS微量元素、B₅有机成分、活性碳0.05％、蔗糖3％、琼脂条的用量为0.8％；

愈伤组织诱导培养基和继代培养基SI：基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸3mg/L和激动素0.2mg/L；

绿苗分化培养基SD：基本培养基附加6-苄基氨基嘌呤2mg/L和萘乙酸0.01mg/L；

壮苗、生根培养基SR：基本培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 2mg/L和萘乙酸0.01mg/L；

培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；

(3)农杆菌转化和共培养

将携带质粒的农杆菌菌液1mL从-70℃的冰箱中取出后，接种到5mLYEB液体培养基中，26℃、200rpm振荡培养24h进行活化，再取活化液1mL接种到50mL YEB液体培养基中，继续振荡培养6h至OD₆₀₀约0.6，用无菌蒸馏水将菌液稀释至OD₆₀₀约为0.3，加入终浓度为100μM的乙酰丁香酮，继续振荡培养2h，将淡黄色颗粒状愈伤组织在农杆菌菌液中浸泡2min，用无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸去多余菌液后接种于愈伤组织继代培养基上培养20～24h；

(4)卡那霉素抗性愈伤组织的筛选

经农杆菌转化和共培养的淡黄色颗粒状愈伤组织，当观察到愈伤组织周围培养基上出现农杆菌菌落时，转入含500mg/L羧苄青霉素的愈伤组织继代培养基，经10-20mg/L卡那霉素抗性筛选，获得具有卡那霉素抗性的愈伤组织；

(5)卡那霉素抗性愈伤组织的分化

将经卡那霉素抗性筛选的颗粒状愈伤组织，转入含500mg/L羧苄青霉素的分化培养基中，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养30～40d；

(6)抗性苗的壮苗、生根培养

把具有3片以上叶的抗性苗，转入壮苗、生根培养基SR：MS基本培养基+苯基脲类细胞分裂素CPPU2.00mg/L+萘乙酸0.01mg/L，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养30～40d至幼苗高度为5cm以上；

(7)抗性苗的移栽及分子检测

去掉封口的棉花塞，加自来水，以水面略高于培养基为宜，冬季在18～25℃的智能温室炼苗2d后，用自来水冲洗干净再生植株根部所带的培养基，移栽至装有大田土壤的塑料盆中；

取移栽成活、综合农艺性状优良的植株幼嫩叶片，提取DNA并进行PCR检测，获得含有目标基因的转化植株；

(8)目的基因表达的转基因植株的获得

对含有目标基因的转化植株，进行目标性状鉴定，获得目标基因表达的转基因植株。