[发明专利]一种构建和生产限制性内切酶Ecop15I的方法有效
| 申请号： | 200810019839.4 | 申请日： | 2008-03-19 |
| 公开（公告）号： | CN101538579A | 公开（公告）日： | 2009-09-23 |
| 发明（设计）人： | 陆毅祥;陈莉;黄兵;孙云成;戴雪;朱远源 | 申请（专利权）人： | 百奥生物技术（南通）有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/55;C12N9/16;C12N1/21;C12R1/19 |
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| 地址： | 226016江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种构建和生产重组III型限制性内切酶Ecop15I的方法。III型限制性内切酶Ecop15I在基因表达系列分析具有重要作用，而传统方法难以实现大规模的表达和纯化。本发明利用基因重组的方法，人工合成融合有纯化标签的Ecop15I的2个亚基片段，分别克隆到原核共表达载体pACYCDuet-1的两个独立表达单元中。在IPTG诱导下，具有独立的T7启动子、核糖体结合位点、起始密码子和终止密码子表达单元在大肠杆菌中，同时独立表达酶的2个亚基，并折叠成具有生物学活性的复合结构。再通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析的方法进行纯化。最终得到了产量较高，活力和稳定性较好的重组型Ecop15I内切酶，从而为大规模生产提供了有效的途径。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 构建 生产 限制性 内切酶 ecop15i 方法 | ||
【主权项】：
1、一种构建III型限制性内切酶EcoP15I共表达质粒(pACYC_P15)的方法，步骤包括：(1)人工合成包含Res亚基和Mod亚基的3段基因，分别为Eco_Mod、Eco_ResI和Eco_ResII，3段基因分别通过平端克隆，装载到pUC57中，获得pMod，pRes_I和pRes_II三个质粒；将pRes_I和pRes_II用BglII和NotI双酶切后，T4连接酶酶连，获得完整的Res片段的pRes_All质粒；(2)将pMod质粒与pACYCDuet-1质粒BamHI和SalI双酶切后酶连，获得包含Mod亚基的pACYC_Mod质粒，再与pRes_All质粒KpnI和XhoI双酶切后酶连，获得包含完整的Ecop15I两个亚基pACYC_P15质粒。
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