[发明专利]一种构建和生产限制性内切酶Ecop15I的方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组III型限制性Ecop15I内切酶共表达质粒的构建、表达与纯 化，属于生物工程领域。通过本发明所提供的方法，获得了纯度较高、活力较 好的重组型Ecop15I限制性内切酶，为大规模生产提供了有效的途径。同时，所 述的Ecop15I内切酶可以作为基因表达序列分析和相关基因识别的工具，具有很 好的应用价值。

背景技术

“限制性内切酶”一般认为是能识别双链DNA上4到8个核苷酸的特异性 序列，且能切割该序列的内切酶的总称。目前，已报道有2900余种限制一修饰 (R/M)系统被鉴别，根据其亚基组成、催化机制、酶切位置、识别序列、辅助 因子等因素，限制性内切酶可分为三大类。I型限制性内切酶是一类兼有限制性 和甲基化活性的多亚基蛋白复合体，可以在远离其识别位点处任意切割DNA链。 II型限制性内切酶是独立于对应甲基化酶的一种限制酶，其在识别位点之中或临 近的确定位点特异性地切开DNA链，产生确定的序列末端、限制片段，II型限 制性内切酶大部分都具有严格的底物特异性，识别4～6bp的回文序列。III型限 制性内切酶是兼有限制、修饰两种功能的酶，主要识别反向重复序列，在识别 位点之外不完全地切开DNA链。

限制性内切酶Ecop15I是大肠杆菌P15质粒编码的III型限制性内切酶，是 由2个Mod亚基和2个Res亚基折叠形成407KDa大小的低聚复合酶。Mod亚 基通过限制与修饰的竞争作用来实现识别和修饰双重功能，其识别未甲基化的、 反向的、非回文结构的序列(5’-CAGCAG-3’)。Ecop15I在识别位点下游上链(Top strand)25～26nt位置和下链(Bottom strand)27或28位置，在辅助因子Mg2+ 和ATP的作用下，酶切DNA序列。特别对DNA具有一对未甲基化的、反向的、 且具有一定空间距离的、对立位置的识别位点，酶切最为有效。其主要用途是 在基因表达分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE^TM)中具有重要作用， 传统的SAGE仅能标签14个碱基序列，而在改进的“longSAGE^TM”方案中也

只有21个碱基序列的标签，而Ecop15I可以标签超过25个碱基序列，提高 了鉴定基因的效率和正确率。Ecop15I对基因的结构和表达的修饰发挥了很大的 作用，从而为各种医学、药物和农业应用提供了巨大的潜力。

III型限制性内切酶Ecop15I在基因表达系列分析具有重要作用，但是目前 缺少实现大规模的表达和纯化的方法。目前生产这种酶的方式和一般限制性内 切酶并无不同，其步骤一般是：

1、通过重组DNA技术，从微生物中获得目的基因并加以克隆。

常使用噬菌体感染用于识别和选择限制性酶的克隆，但此法成功率较低。 这种方法是以包含转移限制-修饰系统为最初特征，由质粒装载到大肠杆菌克 隆载体上。此法通过克隆不断增加的限制-修饰系统，包含通过选择有甲基酶 基因活性地克隆，但这一选择系统并不总是得到完全的限制系统，而是只产生 出甲基化酶基因。在构建质粒库后，然后将其在适用宿主上转化，制备含内切 酶的粗提物，通过活性分析筛选出所需的克隆。

2、采用一些工艺技术对含有限制性内切酶基因的克隆进行过表达。

这些技术能够被单独或结合使用以获得限制性酶最大量的表达，主要有： (1)、启动子通过大肠杆菌能够被很好的识别，直接插入到上游起始部分；(2)、 插入一个位于基因上游的核糖体结合位点；(3)、通过定向诱变或使用密码子自 身合成基因从而改变基因的DNA序列；(4)、使用多聚酶链式反应(PCR)和 合成基因5′端和3′端的杂交引物而放大表达。

3、在合适的培养基中，用发酵器增值携带该内切酶修饰性和限制性的克隆， 以生产该限制性核酸内切酶，然后经离心收获细胞并经超声振荡破坏之，制得 含限制性内切酶活性的细胞粗提物；

4、用标准的蛋白质纯化技术如亲和层析或离子交换层析法纯化含限制性内 切酶活性的细胞粗提物。

采用上述传统方法，对于大规模生产III型限制性内切酶EcoP15I存在以下问 题：