[发明专利]一种构建和生产限制性内切酶Ecop15I的方法

权利要求书

1.一种构建III型限制性内切酶EcoP15I共表达质粒的方法，所述Ecop15I 的Res亚基C端和Mod亚基Ｎ端各自分别融合带有6×His Tag层析标签，其构 建步骤包括：

（1）合成引物，通过两端引物在Mod片段头尾分别添加BamHI、SaII酶 切位点，并在BamHI酶切位点后添加G碱基，获得Eco_Mod基因；在Res片 段头尾分别添加KpnI、XhoI酶切位点，通过Res基因片段中间的Bg1II酶切位 点将Res片段分为两段，为Eco_ResI和Eco_ResII基因；得到包括Res亚基和 Mod亚基的3段基因Eco_Mod、Eco_ResI和Eco_ResII，3段基因分别通过平端 克隆，装载到pUC57中，获得pMod、pRes_I和pRes_II三个质粒；将pRes_I 和pRes_II用Bg1II和NotI双酶切后，T4连接酶酶连，获得完整的Res片段的 pRes_All质粒；

（2）将pMod质粒与pACYCDuet-1质粒BamHI和SalI双酶切后酶连，获 得包含Mod亚基的pACYC_Mod质粒，再与pRes_All质粒KpnI和XhoI双酶切 后酶连，获得包含完整的EcoP15I两个亚基的Ecop15I共表达质粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述层析标签6×His Tag是组氨酸镍 （Ni^2＋）亲和层析标签。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述Ecop15I共表达质粒为过表达质 粒。

4.一种生产III型限制性内切酶EcoP15I的方法，步骤包括：

（1）用重叠PCR方法合成EcoP15I基因，其中Res亚基C端和Mod亚基 Ｎ端各自分别融合带有6×His Tag层析标签；

（2）构建EcoP15I共表达质粒，包括：

a.合成引物，在两端引物的Mod片段头尾分别添加BamHI、SaII酶切位点， 并在BamHI酶切位点后添加G碱基，获得Eco_Mod基因；在Res片段头尾分 别添加KpnI、XhoI酶切位点，通过Res基因片段中间的Bg1II酶切位点将Res 片段分为两段，为Eco_ResI和Eco_ResII基因；得到包括Res亚基和Mod亚基 的3段基因Eco_Mod、Eco_ResI和Eco_ResII，3段基因分别通过平端克隆，装 载到pUC57中，获得pMod、pRes_I和pRes_II三个质粒；将pRes_I和pRes_II 用Bg1II和NotI双酶切后，T4连接酶酶连，获得完整的Res片段的pRes_All质 粒；

b.将pMod质粒与pACYCDuet-1质粒BamHI和SalI双酶切后酶连，获得 包含Mod亚基的pACYC_Mod质粒，再与pRes_All质粒KpnI和XhoI双酶切后 酶连，获得包含完整的EcoP15I两个亚基的Ecop15I共表达质粒；

（3）EcoP15I的转化和表达；

（4）EcoP15I大规模培养和表达；

（5）EcoP15I纯化。

5.根据权利要求4所述的方法，其中纯化EcoP15I-的步骤包括：

（1）镍柱结合缓冲液重悬离心后菌体，超声波破碎菌体，离心取上清粗蛋 白；

（2）过镍亲和层析纯化柱，分步收集；

（3）取纯度和浓度较高的收集样混合、透析；

（4）过阴离子DEAE离子交换层析柱，步进式洗脱，分步收集；

（5）取纯度和浓度较高的收集样混合，透析，测Ecop15I总浓度。