[发明专利]鉴定新基因的方法

摘要

本发明提供了鉴定与所关注基因靶群组中已知基因共有同源区的新基因的方法和组合物。所述方法包括系统地设计寡核苷酸引物并进行所关注有机体核酸材料的连续轮的PCR扩增，所述寡核苷酸引物对已知基因靶群组的核苷酸序列中的同源区是特异性的。PCR步骤意在鉴定和扩增既含有已知基因又含有新基因的核酸。使用对靶群组中已知基因具特异性的寡核苷酸探针，通过斑点印迹分析检测含有已知基因的核酸分子，且出于进一步的考虑，将其除去。将潜在的新基因进行进一步序列分析以证实其新颖性，并测定其生物学活性。本发明的组合物包括包含新基因的新多核苷酸和其变体和片段，以及其编码的多肽。

主权项

1. 鉴定新杀虫基因的方法，所述方法包括：a)设计对杀虫基因靶群组具有特异性的用于第一轮PCR的至少一对寡核苷酸引物，所述引物对含有正向引物和反向引物，其中每个引物靶向存在于靶群组的核苷酸序列中的特征序列；b)从所关注微生物中获得核酸材料的第一样品；c)在适宜PCR扩增的条件下，将核酸材料的第一样品与用于第一轮PCR的至少一对寡核苷酸引物以及热稳定DNA聚合酶混合；d)进行第一轮PCR并检测PCR扩增产物，据此测定PCR产物是否在第一轮PCR中产生；e)如果在第一轮PCR中检测到PCR产物，则从该微生物中获得核酸材料的第二样品；f)设计对杀虫基因靶群组具有特异性的用于第二轮PCR的至少一对寡核苷酸引物，所述引物对含有正向引物和反向引物，其中每个引物靶向存在于靶群组的核苷酸序列中的特征序列；g)在适宜PCR扩增的条件下，将所述核酸材料的第二样品与用于第二轮PCR的至少一对寡核苷酸引物以及热稳定DNA聚合酶混合，并进行第二轮PCR；h)使用琼脂糖凝胶电泳分离第二轮PCR产生的任何PCR扩增产物，并分离用于进一步分析的核酸片段，其中所述核酸片段可能含有推断的新杀虫基因片段；i)将每一个核酸片段克隆入克隆载体；j)用所述克隆载体转化宿主细胞，其中所述克隆载体含有步骤(h)中分离的核酸片段；k)从含有克隆载体的单个宿主集落中制备核酸样品；1)使用对靶群组中所有已知杀虫基因具特异性的标记的探针，对来自单个宿主集落的核酸样品进行斑点印迹分析，其中所述斑点印迹分析步骤未检测到的步骤(h)中分离的核酸片段含有推断的新杀虫基因片段；以及m)分析所述推断的新杀虫基因片段。