[发明专利]鉴定新基因的方法

说明书

发明领域

本发明涉及鉴定与已知基因特别是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)Cry基因同源的新基因的方法和组合物。

发明背景

虫害是全球农作物损失的主要因素。例如，玉米食根虫的损害以及棉籽象鼻虫的破坏可在经济上对农业生产者造成破坏。仅玉米根虫造成的虫害相关的农作物损失已达到每年10亿美元。

传统上，应对虫害群体如玉米根虫群体的主要方法是农作物轮种以及应用广谱的合成化学杀虫剂。然而，消费者以及政府管制者日益担忧与合成的化学杀虫剂的生产和使用有关的环境危害。因为有此担忧，管制者已经禁止或者限制使用一些较为危险的杀虫剂。因此，研发传统化学杀虫剂的替代品具有实质利益，其具有较低的污染和环境危害风险，且提供了比广谱化学杀虫剂更强的靶标特异性特征。

已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些种类具有针对广泛范围的虫害的杀虫活性，所述虫害包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)以及其他的目。苏云金芽孢杆菌(Bt)和金龟子芽孢杆菌(B.papilliae)是目前发现的最成功的生物防治剂之一。昆虫的致病性归因于下列菌株：幼虫芽胞杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、金龟子芽孢杆菌、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、Bt(Harwook，ed.(1989)Bacillus(Plenum Press)，p.306)以及蜡状芽孢杆菌(B.cereus)(国际公布第WO 96/10083号)。尽管从芽孢杆菌营养生长阶段中也分离出杀虫蛋白，但杀虫活性看起来集中于伴胞晶体蛋白包涵体中。已经分离并表征了编码这些杀虫蛋白的几个基因(参见例如美国专利5,366,892和5,840,868)。

微生物杀虫剂，特别是从芽孢杆菌菌株中获得的那些杀虫剂，作为化学虫害防治的替代产品，在农业中发挥了重要作用。从Bt菌株中分离的称为δ-内毒素或Cry毒素的杀虫蛋白最初是以无活性的原毒素形式产生的。这些原毒素通过昆虫肠内蛋白酶的作用以蛋白水解的方式转变成有活性的毒素。参阅Rukmini et al.(2000)Biochimie82：109-116；Oppert(1999)Areh.Insect Biochem.Phys.42：1-12；和Carroll et al.(1997)J.Invertebrate Pathology 70：41-49。毒素的蛋白水解激活可包括从蛋白中除去N和C末端肽，以及蛋白的内部切割。一旦激活，Cry毒素便与昆虫肠内上皮细胞上的受体高亲和性结合，由此，产生细胞膜中的渗漏通道、昆虫肠的溶解和随后由于饥饿和败血症的昆虫死亡。参见，例如Li et al.(1991)Nature 353：815-821。

近来，通过用杀虫基因遗传改造农作物产生芽孢杆菌杀虫蛋白，农业科学家已经研发了昆虫抗性提高的农作物。例如，经遗传改造产生Cry毒素的玉米和棉花(参见例如Aronson(2002)Cell Mol.Life Sci.59(3)：417-425；Schnepf et al.(1998)Microbiol. Mol.Biol.Rev.62(3)：775-806)目前已广泛用于美国农业中，为农场主提供了传统昆虫防治方法的环境友好的替代方法。另外，已经研发了经遗传改造含杀虫Cry毒素的马铃薯。这些利用基因工程的成就促使研究人员探求杀虫基因特别是Cry基因。因此，本领域需要有效鉴定新的杀虫基因包括与已知Cry基因同源的基因以及代表Cry基因新家族的基因的方法。

发明概述

本发明涉及鉴定新基因的方法和组合物。本文公开的方法可快速有效地筛选大量的核苷酸序列来鉴定多种有机体中的潜在新基因。本发明鉴定新基因的方法可鉴定与已知基因同源的基因，以及鉴定完全的新基因，包括杀虫基因，所述新基因是目前尚未被鉴定的所关注的基因家族的成员。在本发明的某些方面中，该方法可鉴定与已知的杀虫基因包括例如Bt Cry毒素基因同源的新杀虫基因。