[发明专利]鉴定新基因的方法

权利要求书

1.鉴定新杀虫基因的方法，所述方法包括：

a)设计对杀虫基因靶群组具有特异性的用于第一轮PCR的至少一对寡核苷酸引物，所述引物对含有正向引物和反向引物，其中每个引物靶向存在于靶群组的核苷酸序列中的特征序列；

b)从所关注微生物中获得核酸材料的第一样品；

c)在适宜PCR扩增的条件下，将核酸材料的第一样品与用于第一轮PCR的至少一对寡核苷酸引物以及热稳定DNA聚合酶混合；

d)进行第一轮PCR并检测PCR扩增产物，据此测定PCR产物是否在第一轮PCR中产生；

e)如果在第一轮PCR中检测到PCR产物，则从该微生物中获得核酸材料的第二样品；

f)设计对杀虫基因靶群组具有特异性的用于第二轮PCR的至少一对寡核苷酸引物，所述引物对含有正向引物和反向引物，其中每个引物靶向存在于靶群组的核苷酸序列中的特征序列；

g)在适宜PCR扩增的条件下，将所述核酸材料的第二样品与用于第二轮PCR的至少一对寡核苷酸引物以及热稳定DNA聚合酶混合，并进行第二轮PCR；

h)使用琼脂糖凝胶电泳分离第二轮PCR产生的任何PCR扩增产物，并分离用于进一步分析的核酸片段，其中所述核酸片段可能含有推断的新杀虫基因片段；

i)将每一个核酸片段克隆入克隆载体；

j)用所述克隆载体转化宿主细胞，其中所述克隆载体含有步骤(h)中分离的核酸片段；

k)从含有克隆载体的单个宿主集落中制备核酸样品；

l)使用对靶群组中所有已知杀虫基因具特异性的标记的探针，对来自单个宿主集落的核酸样品进行斑点印迹分析，其中所述斑点印迹分析步骤未检测到的步骤(h)中分离的核酸片段含有推断的新杀虫基因片段；以及

m)分析所述推断的新杀虫基因片段。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述所关注微生物包括苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株。

3.如权利要求2所述的方法，其中从所关注的所述微生物中获得核酸材料的第一和第二样品包括从苏云金芽孢杆菌菌株中制备质粒DNA。

4.如权利要求1所述的方法，其中从所关注的所述微生物中获得核酸材料包括分离DNA。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述杀虫基因靶群组含有苏云金芽孢杆菌Cry基因。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述靶群组含有对鞘翅目昆虫具杀虫活性的苏云金芽孢杆菌Cry基因。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述第一轮PCR包括进行定量实时PCR。

8.如权利要求7所述的方法，其中在存在荧光体时进行第一轮PCR，所述荧光体能指示PCR产物的存在并提供有关PCR产物数量的信号。

9.如权利要求8所述的方法，其中说是荧光体是染料。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述染料是 Green。

11.如权利要求1所述的方法，其中用于斑点印迹分析的、对靶群组中所有已知杀虫基因具特异性的所述标记的探针经设计，对第二轮PCR中产生的核苷酸片段中的区域具特异性。

12.如权利要求1所述的方法，其中用于斑点印迹分析的所述标记的探针的热解链温度(T_m)为约70℃至约85℃。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述T_m为约80℃。

14.如权利要求5所述的方法，其中第一轮PCR所用的所述至少一对寡核苷酸引物经设计，对苏云金芽孢杆菌Cry基因结构域1中的核苷酸序列具特异性。

15.如权利要求5所述的方法，其中第二轮PCR所用的所述至少一对寡核苷酸引物经设计，对苏云金芽孢杆菌Cry基因结构域2中的核苷酸序列具特异性。

16.如权利要求1所述的方法，其中第一和第二轮PCR所用的所述至少一对寡核苷酸引物的T_m为约50℃至约65℃。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述T_m为约52℃至约56℃。