[发明专利]一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺

摘要

本发明公开了一种生物工程中酶化学，更具体地说，它是应用一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺，其主要技术在于是人源SOD工程菌发酵扩增，离心收集菌体，复合破碎，梯度升温，离心收集上清液、过滤、超滤、冻干，本发明省去生物工程传统制取工艺中的抽提、离子交换、分子筛柱层析等分离、纯化工序。生产流程大大缩短，每生产一次可节约时间30小时，生产成本降低30％，人源SOD产品比活≥10000u/mg(prot)。基因重组人源SOD可广泛应用在药品、保健品、化妆品、酒品、牙膏等SOD产品中。

主权项

1.一 步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺其特征在于：(一)温控分泌型人源SOD菌种将PRPL启动子和STII信号肽及人源SOD基因克隆至PBR322中，构建了分泌型表达质粒PBV/STII/SOD，此质粒带有温控型启动子PRPL，带有STII信号肽，使所表达的外源蛋白以可溶形式分泌到细胞周基质中，将构建的分泌型表达质粒，转化到大肠杆菌W3110，获得重组人源铜锌超氧化物歧化酶菌种；(二)工程发酵培养(1)菌种筛选工艺划线培养→试管培养→挑单菌落→小试表达→扩增培养→生产用菌(2)种子液的制备a.取冻存菌种PBV/STII/SOD1支，用接种环取小量菌种在LB平皿上划线，在30℃培养24小时，b.挑取单菌落接种于LB培养基试管中，30℃，摇床170转/分，培养30小时，(3)、发酵罐培养a.采用改良的M9培养基，b.发酵罐空消：在条件121℃，30分钟，(4)、接种，将单独灭菌的罐培养基分份注入罐内，在灭菌条件下，保护种子液接入发酵罐中，(5)、培养a.诱导培养前，每小时检测一次OD值，并做镜检观察菌形，b.通过转数和通气量来控制溶氧值，c.当罐内菌液OD600值为3.0时进行升温热诱导，诱导温度控制在42℃，d.诱导后继续培养二个半小时，出罐，(三)、离心收集菌体，在GQ-105离心机上进行，(四)、采用复合破碎法：冻融与均质法或超声波破碎法相结合，冻融从室温降至-15℃，温度下降梯度为10℃/小时之后等温冷冻，破碎之前融化，采用均质法两级破碎：一级800bar，二级200bar，酶液1∶3稀释，破碎率达95％以上(五)、复合收取上清液复合破碎菌体破碎率达95％以上，升温梯度为20℃/小时，升温至50℃，温后，再将酶液离心上清，原酶液杂质及各种杂质蛋白为8.4mg/ml，上清液降到2.3-3.5mg/ml，活力回收率达130％，(六)、过滤，过滤采用网眼为0.5μm，0.2μm，双滤心过滤，(七)、超滤采用双超滤网10KD、100KD超滤，超滤后活性达6-10万U/ml，损失率＜10％，(八)、冻干根据需要的活性要求，进行稀配，除盐、灭菌、冻干。