[发明专利]一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程中酶化学，更具体地说，它是应用一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)简称SOD，是一种含金属离子的新型酶制剂，广泛分布于各种生物体内，几乎从动物到植物，都有它的存在。被国际公认为是清除氧化自由基(也称游离基)的特效的酶，人体在正常的新陈代谢或各种激情况下，会产生大量有氧元素的自由基，称为超氧自由基。超氧自由基在人体的过度聚集能加速细胞的衰老和降低机体的免疫功能，甚至诱发肿瘤。SOD则能促使超氧自由基分解，因为作为有害物质的超氧阴离子在SOD的作用下和氢离子反应，生成另一种物质——过氧化氢；过氧化氢又在过氧化氢酶的作用下和氢离子反应，最终生成了一种对人体无害的物质——水，从而消除其对人体的损害，它在一定程度上有防止肿瘤发生、抗衰老、提高机体免疫力的作用，因而被用于某些急性炎症、自身免疫性疾病、营养缺乏、肿瘤等的辅助治疗。

1969年Mcord和Fridvich从牛血发现并提取出超氧化物歧化酶以来，SOD的生产取得了重在进展。目前，生产SOD大体上有二种方法，第一方法是传统方法，从动物血中提取SOD，由于血制品SOD存在外源感染的危险性和非人源制品SOD用于人体有抗原性，在医疗中很难发挥作用，而且成本高，原料来源有限，欧洲从1999年就禁止长期用于人体上；第二种方法是植物中提取SOD，虽然可以消除病毒、外源性污染等弊端，但由于植物中SOD含量低，很难实现工业批量生产。上述提取SOD生产流程，都是采用传统工艺中的抽提、离子交换、分子筛等分离、纯化工序，提取过程复杂，收率低。目前，尚未发现把当代生物科学技术应用到SOD产业中，采用一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺，基因重组生产SOD是当含世界最前沿技术，基因重组生产SOD具有无外源性污染、无免疫排斥、无蛋白种属差异、无病毒残存，且纯度高、活性高，最适于人体，是SOD产业从技术到质量上的一次革命。

发明内容

本发明的目的是克服现有提取SOD技术中的不足，提供一种具有无外源性污染、无免疫排斥、无蛋白种属差异、无病毒残存，且纯度高、活性高的一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺，更好地发挥SOD对急病其预防、治疗的作用。

本发明提出的一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺，其主要技术在于：

一、温控分泌型人源SOD菌种，应用基因重组技术将PRPL启动子和STII信号肽及人SOD基因克隆至PBR322中，构建了分泌型表达质粒PBV/STII/SOD。此质粒带有温控型启动子PRPL，带有STII信号肽，使所表达的外源蛋白以可溶形式分泌到细胞周基质中，给外源蛋白的进一步纯化带来方便。将构建的分泌型表达质粒，转化到大肠杆菌W3110，获得重组人源铜锌超氧化物歧化酶菌种。

超氧化物歧化酶温控分泌型菌种构建，见附图。

二、工程发酵培养

1、菌种筛选工艺

划线培养→试管培养→挑单菌落→小试表达→扩增培养→生产用菌

2、种子液的制备

a.取冻存菌种1支，用接种环取小量菌种在LB平皿上划线，(LB培养液的制备：蛋白胨56g，酵母粉28g，NaCe56g，溶液5.6L)30℃培养20-24小时。

b.挑取单菌落接种于LB培养基试管中，30℃，150-180转/分，培养10-15小时，待OD值达18-20，接种于发酵罐中。

3、发酵罐培养

a、采用改良的M9培养基，(M9培养基的的制备：80L发酵罐中蛋白胨800g，酵母粉500g，NaHPO₄320g，KH₂PO₄110g，NaCe100g，NH₄Ce70g，MgSo₄13.4g，CaLe0.5g，CuSo₄10g，ZnSo₄0.5g，葡萄糖600g。)。

b.发酵罐空消：条件121℃，30分钟。

4、接种，将单独灭菌的罐培养基分份注入罐内，在灭菌条件下，保护子液接入发酵罐中。

5、培养

a.诱导培养前，每小时检测一次OD值，并做镜检观察菌形。

b.通过转数和通气量来控制溶氧值。

c.当罐内菌液OD600值为3.0时进行升温热诱导，诱导温度42℃。

d.诱导后继续培养二个半小时，出罐。

三、离心收集菌体