[发明专利]一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺

权利要求书

1.一 步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺其特征在于：

(一)温控分泌型人源SOD菌种

将PRPL启动子和STII信号肽及人源SOD基因克隆至PBR322中，构建了分泌型表达质粒PBV/STII/SOD，此质粒带有温控型启动子PRPL，带有STII信号肽，使所表达的外源蛋白以可溶形式分泌到细胞周基质中，将构建的分泌型表达质粒，转化到大肠杆菌W3110，获得重组人源铜锌超氧化物歧化酶菌种；

(二)工程发酵培养

(1)菌种筛选工艺

划线培养→试管培养→挑单菌落→小试表达→扩增培养→生产用菌

(2)种子液的制备

a.取冻存菌种PBV/STII/SOD1支，用接种环取小量菌种在LB平皿上划线，在30℃培养24小时，

b.挑取单菌落接种于LB培养基试管中，30℃，摇床170转/分，培养30小时，

(3)、发酵罐培养

a.采用改良的M9培养基，

b.发酵罐空消：在条件121℃，30分钟，

(4)、接种，将单独灭菌的罐培养基分份注入罐内，在灭菌条件下，保护种子液接入发酵罐中，

(5)、培养

a.诱导培养前，每小时检测一次OD值，并做镜检观察菌形，

b.通过转数和通气量来控制溶氧值，

c.当罐内菌液OD600值为3.0时进行升温热诱导，诱导温度控制在42℃，

d.诱导后继续培养二个半小时，出罐，

(三)、离心收集菌体，在GQ-105离心机上进行，

(四)、采用复合破碎法：冻融与均质法或超声波破碎法相结合，冻融从室温降至-15℃，温度下降梯度为10℃/小时之后等温冷冻，破碎之前融化，采用均质法两级破碎：一级800bar，二级200bar，酶液1∶3稀释，破碎率达95％以上

(五)、复合收取上清液

复合破碎菌体破碎率达95％以上，升温梯度为20℃/小时，升温至50℃，温后，再将酶液离心上清，原酶液杂质及各种杂质蛋白为8.4mg/ml，上清液降到2.3-3.5mg/ml，活力回收率达130％，

(六)、过滤，过滤采用网眼为0.5μm，0.2μm，双滤心过滤，

(七)、超滤采用双超滤网10KD、100KD超滤，超滤后活性达6-10万U/ml，损失率＜10％，

(八)、冻干根据需要的活性要求，进行稀配，除盐、灭菌、冻干。

2. 根据权利要求1所述的一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺，其特征在于：100L发酵罐SOD活性达6000万-1亿U，冻干粉活性3500U/mg，每罐蛋白量达10g，活性收率达50-70％，比活＞10000u/mg。

3. 根据权利要求1所述的一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺其特征在于：目的蛋白人源铜、锌超氧化歧化酶其分子量为32KD。

4. 一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺其特征在于：LB培养液的制备：蛋白胨56g，酵母粉28g，NaCe56g，溶液5.6L。

5. 一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺其特征在于改良M₉培养基的制备为80L发酵罐中蛋白胨800g，酵母粉500g，NaHPO₄320g，KH₂PO₄110g，NaCe100g，NH₄Ce70g，MgSo₄13.4g，CaLe0.5g，CuSo₄10g，ZnSo₄0.5g，葡萄糖600g。