[发明专利]同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定其药物抗性的方法及所用材料

摘要

本发明涉及分子生物学、微生物学、和医学，并且提供在区分性生物芯片上在临床样品中检测结核分枝杆菌复合体并同时评价菌株对利福平和异烟肼的敏感性的方法。该方法基于2步多重PCR来获得荧光DNA片段，然后让这些片段在包含特异的区别性寡核苷酸组的微阵列上杂交。通过评价在微生物DNA中的点核苷酸取代来确定结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的抗性。本发明允许直接分析临床样品，以便能同时评价大量突变，从而降低分析成本，减少实施时间。本发明还涉及用于实现该方法的引物组、生物芯片、和寡核苷酸探针组。

主权项

1.一种用于在临床样品中同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定导致微生物对利福平和异烟肼产生抗性的分枝杆菌DNA突变的方法，其包括：(A)-使用一组用于第一PCR步骤的特异性引物对，多重扩增rpoB、katG、inhA、ahpC基因、IS6110可动因子的片段；(B)-使用在步骤(A)中获得的PCR产物作为模板、和一组用于第二PCR步骤的特异性引物对来多重扩增rpoB、katG、inhA、ahpC基因、IS6110可动因子的片段，其中每对引物中有一个引物被荧光标记以获得主要是单链荧光标记的片段；(C)-制备能够同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定导致对利福平和异烟肼产生抗性的突变的生物芯片，所述生物芯片由具有胶垫的基质组成，每个垫中固定有独特的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸的序列选自如下序列：a)与野生型rpoB基因片段序列相应的序列；b)与导致微生物对利福平产生抗性的突变型变体rpoB基因片段序列相应的序列；c)与a)和b)中描述的序列互补的序列；d)与野生型katG基因片段序列相应的序列；e)与导致微生物对异烟肼产生抗性的突变型变体katG基因片段序列相应的序列；f)与d)和e)中描述的序列互补的序列；g)与野生型inhA基因片段序列相应的序列；h)与导致微生物对异烟肼产生抗性的突变型变体inhA基因片段序列相应的序列；i)与g)和h)中描述的序列互补的序列；j)与野生型ahpC基因片段序列相应的序列；k)与导致微生物对异烟肼产生抗性的突变型变体ahpC基因片段序列相应的序列；1)与j)和k)中描述的序列互补的序列；m)与可动因子IS6110的序列相应的序列；o)与描述于m)中的序列互补的序列；(D)-在能为杂交时形成的区配和错配的双链体之间提供一个核苷酸的分辨率的条件下，在生物芯片上让在步骤(B)中获得的扩增出的标记产物杂交；(E)-记录和解析杂交数据。