[发明专利]同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定其药物抗性的方法及所用材料

权利要求书

1.一种用于在临床样品中同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定导致微生物对利福平和异烟肼产生抗性的分枝杆菌DNA突变的方法，其包括：

(A)-使用一组用于第一PCR步骤的特异性引物对，多重扩增rpoB、katG、inhA、ahpC基因、IS6110可动因子的片段；

(B)-使用在步骤(A)中获得的PCR产物作为模板、和一组用于第二PCR步骤的特异性引物对来多重扩增rpoB、katG、inhA、ahpC基因、IS6110可动因子的片段，其中每对引物中有一个引物被荧光标记以获得主要是单链荧光标记的片段；

(C)-制备能够同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定导致对利福平和异烟肼产生抗性的突变的生物芯片，所述生物芯片由具有胶垫的基质组成，每个垫中固定有独特的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸的序列选自如下序列：a)与野生型rpoB基因片段序列相应的序列；b)与导致微生物对利福平产生抗性的突变型变体rpoB基因片段序列相应的序列；c)与a)和b)中描述的序列互补的序列；d)与野生型katG基因片段序列相应的序列；e)与导致微生物对异烟肼产生抗性的突变型变体katG基因片段序列相应的序列；f)与d)和e)中描述的序列互补的序列；g)与野生型inhA基因片段序列相应的序列；h)与导致微生物对异烟肼产生抗性的突变型变体inhA基因片段序列相应的序列；i)与g)和h)中描述的序列互补的序列；j)与野生型ahpC基因片段序列相应的序列；k)与导致微生物对异烟肼产生抗性的突变型变体ahpC基因片段序列相应的序列；1)与j)和k)中描述的序列互补的序列；m)与可动因子IS6110的序列相应的序列；o)与描述于m)中的序列互补的序列；

(D)-在能为杂交时形成的区配和错配的双链体之间提供一个核苷酸的分辨率的条件下，在生物芯片上让在步骤(B)中获得的扩增出的标记产物杂交；

(E)-记录和解析杂交数据。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在多重PCR的第一步骤(A)中使用的该组特异性引物对的序列为SEQ ID NO：70、71、74、75、77、78、80、81、83、84。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，在多重PCR的第二步骤(B)中使用的该组特异性引物对的序列为SEQ ID NO：72、73、74、76、77、79、80、82、83、85。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于，在多重PCR的第二步骤(B)中使用的荧光标记的引物相对于来自该引物对的另一引物来说是摩尔过量的，以便对于所有引物对都获得主要是单链荧光标记的片段。

5.根据权利要求1的方法，其中基因和可动因子IS6110的片段的扩增直接使用来自临床样品的材料(痰、渗出物、洗出液、支气管肺泡灌洗液)或微生物的初步生长培养物来进行。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用的生物芯片包含具有由SEQ ID NO：1-69所示序列的固定的寡核苷酸组。

7.根据权利要求1的方法，其特征在于使用杂交缓冲液，该缓冲液允许在扩大的温度区间内进行杂交以便为杂交时形成的匹配和错配的双链体之间提供一个核苷酸的分辨率。

8.根据权利要求1的方法，其特征在于使用便携式荧光分析仪和软件进行步骤(E)中的数据记录，所述软件允许进行信号强度的自动处理以用于随后的数据解析。

9.根据权利要求1的方法，其中在步骤(E)中获得的数据的解析是通过比较垫中的荧光信号强度来进行的，在所述垫中形成了匹配和错配的杂交双链体。

10.根据权利要求1的方法，其中解析结果可以用于利用存在一个或另一个作为标记的突变来证实结核病的临床诊断和进行流行病学遗传分型。

11.特异性引物对组，所述引物对组用于实现在临床样品中同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定导致菌株对利福平和异烟肼产生抗性的分枝杆菌DNA突变的方法，其中所述引物的序列为SEQ ID NO：70-85。