[发明专利]系统性病毒/配体基因输送系统和基因治疗

说明书

发明背景

1、技术领域

本发明涉及对基因转移和基因治疗技术的改良。本发明尤其提供了在体内和体外将核酸经病毒定向输送至人和其它动物的特异器官、组织或肿瘤中的组合物及方法。使用本发明输送治疗性基因例如wtp53，可提高对常规放疗和化疗的敏感性。

2、背景技术

用病毒载体输送基因和基因治疗已经进行研究。癌症基因治疗中的长期目的是一个系统性输送系统，其选择性定向于肿瘤细胞，包括转移的癌细胞。核酸可以经病毒载体导入细胞，以对那些细胞产生所需的治疗作用。例如，可以导入基因以置换干扰细胞功能的有缺陷的基因，例如p53。核酸也可导入细胞中以在宿主动物体内产生所需的治疗作用，例如免疫接种，免疫治疗，或反义表达。

通过病毒将其核酸转移到宿主细胞所用的进入细胞的机制，已开发了病毒载体。用此策略已经构建了重组逆转录病毒和腺病毒载体，以在体内和体外转移基因。已用于临床治疗的几乎80％的基因治疗方案都利用病毒载体(Wivel和Wilson，1998)。腺病毒载体对一些基因治疗方式有利，因为它们能进入未分化的细胞并携带相对较大(78kb)的外源DNA(Berkner，1988)。另外，腺病毒颗粒可以滴度高于1011PFU/ml纯化和生产(Wivcl和Wilson，1998)。然而，这些系统的一个缺点是病毒的细胞嗜性受限，且目前用于临床治疗癌症的任何治疗性病毒中，定向病毒颗粒这一主要问题还未解决。因此已研究并持续进行探求改变基因嗜性的方法。

现已阐述了一种通过双功能缀合物改变逆转录病毒嗜性的系统(Roux等，1989)。此双功能缀合物含有一个抗病毒衣壳的抗体，和一个抗靶细胞特异细胞膜标记的抗体。

Groud等(1988)阐述了由两个单克隆抗体(MAbs)组成的双功能缀合物。此MAbs抗Moloney逆转录病毒的gp70衣壳蛋白和人运铁蛋白受体。这些缀合物使逆转录病毒侵入本来不能进入的靶细胞。

WO92/06180(Wu等，1992)阐述了一种改变病毒嗜性的方法，该方法是将具有与靶细胞表面受体结合的分子提供给病毒表面，产生与具有细胞表面受体的细胞有特异性的病毒。在该发明中，逆转录病毒或乙型肝炎病毒是用与脱唾液酸糖蛋白受体结合的碳水化合物分子化学修饰的。Wu等只揭示了将外源基因导入细胞的体外方法。

腺病毒载体对一些基因治疗方式有利，因为它们能进入未分化的细胞，并能携带大约8kb的外源DNA序列，腺病毒颗粒可以高于1011pFUs/ml滴度纯化及生产。

使用重组腺病毒的一个问题是其定向特异细胞类型的受限制性。许多研究已经报道用具有DNA复合物的非重组腺病毒经受体介导的胞吞作用转移基因，腺病毒提供释放内体成分的能力(Cotton等，1992；Wagner等，1992。)。这些方法是用运铁蛋白－聚赖氨酸/DNA复合物来内在化结合或未结合的腺病毒。Wagner等(1992)修饰了一种腺病毒载体，其通过与聚赖氨酸缀合，并将其与运铁蛋白－聚赖氨酸/DNA的缀合物复合，产生三元的运铁蛋白－聚赖氨酸/腺病毒－聚赖氨酸/DNA复合物。一种相似的定向方法是利用在许多类型肿瘤中，运铁蛋白受体(TfR)增加这一事实，将运铁蛋白(Tf)与腺病毒颗粒连接起来(Miyamoto，等，1994；Baselga和Mendelsohn，1994)。Schwarzenberger等(1997)阐述了分子缀合物载体(MCVs)。MCVs是通过将含有相应基因的质粒与聚赖氨酸(PL)凝聚起来而构建的，PL与复制功能不全的腺病毒(内体化因子)连接，而且PL与链霉亲和素连接以用生物素酰化的配体定向。然而，现已报道(Cotton等，1992；Wagner等，1992；Schwarzenberger等，1997)目前共价偶联Tf与腺病毒的方法，或产生Tf－聚赖氨酸－腺病毒缀合物的方法通常导致感染性降低，可能是由于产生Tf-修饰的病毒所需的苛刻条件所致。

另一种方案必需将中性化的抗纤维或抗结(knob)单克隆抗体的Fab片段与配体如叶酸或FGF2交联(Rogers等，1997；Douglas等，1996)。与嵌合的Fab-配体复合的腺病毒载体在肿瘤定位方面已显示出一些优势，并与天然腺病毒相比较呈现在体内对肝的毒性降低。

Curiel等(美国专利No.5521291和No.5547932)阐述了多重腺病毒－聚阳离子缀合物，以将核酸内在化引入真核细胞。这些缀合物中有一些使用运铁蛋白作为内在化因子，运铁蛋白与对核酸有亲和性的物质结合。