[发明专利]抗凝剂和人源化抗冯·维勒布兰德氏因子的单克隆抗体

说明书

本发明的领域

抗人源von Willebrand因子的人源化单克隆抗体，是一种能产生抗体细胞和含有上述抗体作为活性成分的抗凝剂。

本发明的背景

由于受伤，内皮下组织暴露于外面时，在血管内流动的血小板立即与内皮下组织粘合。此情况引发一序列血小板活化过程，包括血小板凝集和释放细胞内颗粒，而后形成血栓，出血停止。血栓的形成对生理止血机理是必要的。但是，血栓可引起许多血栓病如心肌梗塞、胸绞痛、大脑梗塞和脑血栓。

已开发许多抗凝剂用以治疗血栓疾病。但是，许多现有的抗凝剂在临床应用方面效率低、血栓特异性低，引起出血副作用。

在血栓形成的初级阶段起作用的一种重要的蛋白质是血浆中的vonWillebran因子(“vWF”)。随着vWF内量变和质变的出现而发生的出血区表明是yon Willebrand病(“vMD”)。已知几种抗vWF的抗体：Fujimura等在J.Nara Med.Assoc.,vol.36,662(1985)公开的NMC-4；Tuddenham等在Blood,vol.177,no.1,113(1992)公开的RFF-VIIIRAG:1；Nagano等,在PCT/JP95/02435公开的由杂交瘤AJvW-1,AJvW-2,AJvW-3,和AJvW-4制备的单克隆抗体(在此引入作为参考)。

本发明提供以由杂交瘤AJvW-2制备的抗体为基础的人源化抗体。此种鼠源单克隆抗体可有效地抑制vWF的生理活性，而且可用于治疗血栓病。不幸的是，将使用如来自AJvW-2的鼠源单克隆抗体用于治疗人类疾病有些特定的缺点，尤其是用于反复治疗区。而且，鼠源单克隆抗体用于人类时，其寿命缩短一半并缺乏其它重要的免疫球蛋白的功能特性。更重要的是，将鼠源单克隆抗体注射到病人体内后，含有免疫原性的大量氨基酸序列。大量的研究已表明，注射外来抗体后，病人体内引发的抵抗注射抗体的免疫反映很强烈，消除了最初治疗后抗体的治疗有效性。而且，如果鼠源或其它抗原(对人)单克隆抗体用于治疗人类疾病，那么，在随后的治疗中如用不相关的鼠源抗体可能是无效的，甚至由于交叉反应是危险的。

虽然已证明生产所谓的嵌合抗体(如与人源不变区连接的鼠源可变区)取得成功，但还存在有效免疫原性问题(见LoBuglio A.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,4220-4224(1989)；M.N.Saleh等，HumanAntibod.Hybridomas e:19(1992))。

通常，用常用的人源单克隆抗体生产技术生产可与vWF高亲和性的人源免疫球蛋白是非常困难的。因此，需要改善专用于von Willebrand因子的人源化免疫球蛋白的形态，实质上，vWF在人体内是非免疫原性的，且可用适合于治疗制剂和其它用途的方式，即容易又经济地生产。本发明可实现这些和其它需求。

本发明的概述

本发明的一个目的是提供人源免疫球蛋白，如抗von Willebrand因子的单克隆抗体，鼠源抗体AJvW-2的人源化形态，编码免疫球蛋白的多核苷酸序列；生产免疫球蛋白的方法；由免疫球蛋白作为活性成分的药物组合物；由作为活性成分的抗体组成的用于治疗血栓疾病的治疗剂和治疗上述疾病的方法。

附图的简要描述

图1(a)是AJvW-2,SEQ ID NO:1的重链可变区序列。

图1(b)是AJvW-2,SEQ ID NO:2的轻链可变区序列

图2(a)是人源化AJvW-2,SEQ ID NO:3的重链可变区序列。

图2(b)是人源化AJvW-2,SEQ ID NO:4的轻链可变区序列。

图3是鼠源和人源化AJvW-2抗体(IgG4和IgG2m3)与vonWillebrand factor竞争粘合特性的图。

本发明的详细描述

根据本发明，提供了专与人源von Willebrand因子反应的人源化免疫球蛋白。在瑞斯托菌素(ristocein)或botrocetin的存在下，这些免疫球蛋白能够抑制vWF与GPIb蛋白质粘合，其与vWF的粘合亲和性至少约为10⁷M^-1-10¹⁰M^-1，优选为10⁸M^-1-10¹⁰M^-1，或更强。