[发明专利]采用还原剂的改进型免疫诊断分析

说明书

发明领域

本发明涉及HCV感染的诊断和治疗领域。更具体地说，本发明涉及HCV NS3解旋酶及其应用。本发明也涉及改良的免疫诊断测定。

发明背景

丙型肝炎病毒(HCV)构成黄病毒科中的一属，它与庚型和庚乙型肝炎病毒以及鼠疫病毒(Pestiviruses)的同种性最接近。正链RNA基因组编码至少9种蛋白质。核心E1和E2组成结构蛋白。NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B是非结构(NS)蛋白。HCV分离物表现出高水平的序列异质性，使其分类为至少11个型和90个亚型(Maertens和Stuyver,1997)。人类肝脏的HCV感染通常在临床上是良性的，在急性期伴有轻度的黄疸。在一些急性转归型丙型肝炎病例中，所述疾病甚至可以隐性进展。然而，在大部分(＞70％)病例中，HCV感染可导致慢性迁延性或活动性感染，常常伴有肝硬化和自身免疫性疾病的并发症。在大约20-35年以后可能会发生肝细胞性肝癌(Saito等，1990)，有时甚至没有肝硬化的中间期。根据HCV的基因型，目前还无法预防，并且用α-干扰素(IFN-α)治疗也仅能导致约4-36％的治疗病例长期治愈(Maertens和Stuyver,1997)。

由于HCV的增殖培养方法目前还无法使用，而且仅有少量的HCV抗原在感染的患者体内循环，因而无法常规进行HCV颗粒的直接检测，仅能采用麻烦的用于HCV RNA检测的扩增技术间接诊断。与许多其它的病毒感染不同，HCV颗粒通常持续存在于血液、肝脏和淋巴细胞中，尽管对大部分HCV蛋白存在着细胞和体液免疫应答。HCV抗体能方便地用酶联免疫吸附测定技术检测，其可用于血库和临床实验室中的大量筛查。辅助抗体试验是必需的，并且目前在大部分国家是强制性的。由于血清或血浆免疫球蛋白或抗独特型成分与包被或阻断试剂、或与存在于HCV抗原制备物中的污染物、甚或与重组抗原本身的融合部分或非特异区域的非特异性结合可引起假性反应，因此需从假性反应中鉴别出真性HCV反应(McFarlane等，1990)。近来已将HCV RNA的PCR检测或分支DNA(bDNA)技术引入监测慢性HCV疾病，尤其是在治疗期间。令人惊奇的是，HCVRNA检测有时被用于确认HCV Ab筛查试验，尽管事实是仅有约70-94％的重复HCV Ab阳性患者样品由嵌套式PCR检测为阳性(Marin等，1994)。对于HCV Ab阳性血液供体，其通常表现为较轻型的疾病和低HCV RNA水平，用嵌套式PCR确认通常约为40％(Waumans等，1993；Stuyver等，1996)。因而以条带为基础的(Strip-based)检测提供了唯一可选择的可靠的HCV Ab确认方法。甚至在确定性试验中未确定结果的情况下，所述患者的血清学随访是可取的，而非HCVRNA测定(Di Bisceglie等，1998)。由于天然的HCV抗原无法以足够的量使用，因此这种确定性试验需加入HCV蛋白的合成肽和/或重组片段。在抗体的确认中最关键的问题之一为NS3蛋白的反应性(Zaaijer等，1994)。NS3抗体常最先出现在血清转变系列中，并且在当今使用的各种商业检测中NS3蛋白的反应性似乎各不相同。

无基因(Innogenetics)引入条带(strip)技术原理，其中通常将合成肽和重组蛋白的结合以顺序和易读的方式用作不连续的线。INNO-LIA HIV Ab试验已证实优于常规使用的蛋白质印迹法(Pollet等，1990)。线性免疫测定允许多参数试验，并因此使截断和其它速率系统、加样控制以及对非HCV蛋白的假反应性试验的结合成为可能，该非HCV蛋白作为Elisa试验中某些抗原所需的载体或融合配偶体使用。原则上，所述试验设计允许将不同病原体或表型相关病症的抗原合并到单个试验中。

所述INNO-LIA HIV AbⅢ是第三代线性免疫测定，其引入了得自核心区、E2高变区(HVR)、NS3解旋酶区和NS4A、NS4B及NS5A区的HCV抗原。在第三代测定中，高纯度的重组亚型1b NS3蛋白和E2肽使高度敏感性成为可能，从而保证了可靠的特异性，这是以肽为基础的测试的特性(Peeters等，1993)。也许这种测定的最重要的特性之一是其与HCV RNA阳性的前所未有的相关性(Claeys等，1992；De Beenhouwer等，1992)。