[发明专利]适合生产蛋白质的表达系统

说明书

本发明涉及适合在栓菌或多孔菌属真菌内生产蛋白质的表达系统、其制备及用途。

对于蛋白质生产各种不同的原核及真核的表达系统是已知的。原核的表达系统的实例为大肠杆菌及枯草杆菌。这些生物的基因操作法的地位已很稳固。这些表达系统特有的缺点是经常令人失望的低产率(尤其是真核蛋白质的产率)，所产蛋白质的折叠常使其不呈活化型，而且，特别是，缺乏对表达的蛋白质的转译后修饰。缺乏转译后修饰的实例，为待表达的蛋白质缺乏辅基的掺入或缺乏糖基化作用。

这些原核的表达系统的缺点可用真核系统避免之。

普遍的真核表达系统广泛应用在哺乳动物细胞与昆虫细胞培养系统，及真核微生物，如酵母或丝状真菌。用这些表达系统表达的蛋白质，通常产出时为活化型，在若干实例，产率太低，特别是异源蛋白质的表达。在酿酒酵母中或子囊菌纲的丝状真菌中表达可做为该表达的实例。

据说在丝状真菌(如曲霉)中产率高，尤其在同源蛋白质或子囊菌纲丝状真菌的蛋白。异源蛋白质的表达通常仅在低产率或中产率时进行。例如WO96/00290即说明源于Polyporus pinsitus、担子菌纲丝状真菌的漆酶LCC1的异源表达。至于在曲霉、担子菌纲丝状真菌中表达，发酵的产率高达0.35克/升，与类似的野生型菌株发酵的产率为0.1-0.2克/升相比，此尚属较小增产。

大家对在工业上应用酶(特别是担子菌纲的酶)，兴趣日益增高，其中又以白色腐败真菌最为特殊。实例为水解酶，如纤维素酶、半纤维素酶或脂肪酶，或氧化还原酶，如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维二糖-醌氧化还原酶或纤维二糖氧化酶。这些酶的潜在用途为木材或纤维素加工。

担子菌纲中出现一类酶，漆酶(对一羟基酚氧化酶，EC1.10.3.2)，大家对其工业上应用最感兴趣。漆酶属于称为“蓝铜蛋白”的蛋白质家族，通常含有四个铜离子排列成三个铜中心，称为型1至型3。漆酶其他特征为系分泌蛋白质而且可能尚有糖基化作用含量，占分子量的10至45％。除对大分子化合物(如木质素)具有解聚(作用)之外，漆酶尚能催化聚合作用，特别是芳香化合物。其实例为在植物中木质素生物合成，其中与植物中的漆酶直接有关。工业界似可用漆酶于制纸时纸浆的去木质化作用，并用于各种聚合反应，如废水处理。有机化学合成用漆酶，乃既有技术，例如芳香族化合物之偶联反应或侧链氧化。然而在工业上应用这些方法的先决条件为漆酶的生产成本比较低及需用量相当大。

对于担子菌纲各种不同的丝状真菌，据说DNA载体适合转化作用与转化株的选择。同种转化担子菌纲Phanerochaete chrysosporium的方法已见于刊物(M.Alic et al.(1991)Curr.Genet.19,491-494)。转化担子菌纲Pleurotus ostreatus的DNA-结构已见于刊物(K.Yanai etal.(1996)Biosci.Biotech.Biochem.60,472-475)。美国第5,362,640号专利说明转化担子菌纲Coriolus hirsutus的DNA载体。同样，一转化担子菌纲Coriolus hirsutus的DNA-载体己见于刊物(Y.Iimura etal.(1992)5^th International Conference on Biotechnology in the Pulp andPaper Industry,427-431)。迄今尚未公开者，为转化担子菌纲如下表达系统中的任何一种系统，这些系统大幅提高同源或异源蛋白质的表达率。

习知表达载体含有控制在子囊菌纲丝状真菌中表达的基因调节元件，无法在担子菌纲丝状真菌内有效表达。因此，在转化担子菌纲丝状真菌时，无法基于后天获得的抗生素抗性或生色指示蛋白质，或基于营养缺陷型基因缺陷的互补作用选择阳性转化株。

本发明涉及在丝状真菌中适合生产蛋白质的表达系统，该表达系统含有：

a)由栓菌与多孔菌属选出的宿主生物及

b)含有编码蛋白质的选择标志基因的DNA载体，其于宿主生物转化后，则准许选择阳性转化株，该基因由下述一组基因中选出：编码破坏抗生素的抑制生长作用(宿主生物无抗生素抗性)的蛋白质的抗生素抗性基因、编码有生色反应能力的蛋白质的基因，及互补宿主生物(营养缺陷型)基因缺陷的基因，其中选择标志基因的表达至少由一在宿主生物中活化的基因调节元件控制，及