[发明专利]在原核细胞有控制地表达重组蛋白质的新构建体

说明书

本发明涉及用于在原核宿主细胞中表达处于Ptrp色氨酸操纵子启动子的控制之下的重组目标蛋白编码基因的新构建体，其特征在于该构建体包含当导入所述宿主细胞中时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列。本发明还涉及含有所述构建体的载体和转化了所述载体的宿主细胞。本发明的另一个主题是用所述新构建体产生所述重组蛋白的方法。

广义地讲，本发明用于通过所谓的重组DNA方法生产重组多肽或蛋白。更具体地，本发明涉及通过转化的宿主细胞生产重组多肽或蛋白，所述宿主细胞是细菌类型的，并且其中表达是由Ptrp色氨酸操纵子的启动子/操纵基因指导或控制的(Nichols和Yanofsky,1983)。

大肠杆菌(E.coli)是用于生产重组蛋白的最常用和阐述最清楚的生物。在大肠杆菌中可使用多种表达系统，其中，Ptrp色氨酸操纵子的启动子被认为是最强的启动子之一(Yansura和Bass,1997)。

但是，并非所有重组基因都可被大肠杆菌以相同效率表达。已有描述和观察称，在转化宿主细胞的培养过程中重组蛋白的积累会迅速导致质粒不稳定、细胞生长减慢甚至停滞以及重组产物总产量的降低。在这种情况下，重要的是能获得一种受控制和调节的表达系统，该系统可将生产过程划分为两个阶段：第一个称为细胞生长阶段，在该阶段中启动子活性最小，接着是所谓的诱导或去阻遏阶段，该阶段有利于重组蛋白的表达和积累。

大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子Ptrp由于具有可诱导特性，故适合生产重组蛋白。在Ptrp操纵基因水平上的阻遏是通过trpR调节基因的产物来进行的，此时该产物，也称trp阻遏物蛋白，与色氨酸(辅阻遏物)结合。色氨酸的缺乏使该TrpR蛋白不能结合操纵基因，从而引起色氨酸操纵子的去阻遏。在Ptrp控制下表达异源基因的各种例子表明，由此产生的表达渗漏太大，而不能在满意的条件下生产重组蛋白，特别是那些对细胞有毒的蛋白(Yansura和Henner,1990)。

TrpR调节蛋白遵从一种自调节机制(Kelley和Yanofsky,1982)，并且，其浓度在过量外源色氨酸存在时趋向于平均值120分子/大肠杆菌K-12细胞(Gunsalus,Gunsalus Miguel和Gunsalus,1986)。尽管该浓度足以正确调节单个Ptrp染色体启动子的活性，但对于数十个含有相同启动子的载体，该浓度可能显得有限。至于色氨酸，即使它在培养基中过量提供，它也可能是一个限制因素。事实上，大肠杆菌中存在tanA基因编码的色氨酸酶活性，该活性能将色氨酸降解成吲哚，从而改变了它的调节功能(Snell,1975)。此外，色氨酸酶可被色氨酸诱导，这使得任何用增加色氨酸供给补偿这种降解现象的尝试没有意义。

人们展望和描述了企图获得对表达渗漏的最可能的控制的各种方法。然而，有些具有只能在实验室规模上应用的缺点(Hasan和Szybalski,1995；Suter-Crazzolara和Unsicker,1995)，或具有减少重组产物产量的缺点(Stark,1987)。

因此，现在非常需要发展一种可在大规模上使用，并且特别地，可控制表达渗漏的目标重组蛋白有控制的表达系统。这正是本发明的主题。

本发明涉及基于Ptrp表达系统的多种新构建体，当导入原核宿主细胞优选细菌类型的原核宿主细胞时，该构建体可在培养开始时降低重组基因的残余表达，这些新构建体提供了对重组蛋白合成的改善的控制。

本发明的一个主题是在原核宿主细胞中表达处于Ptrp色氨酸操纵子启动子控制下的目标重组蛋白编码基因的构建体，其特征在于该构建体包含在被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列。

术语“目标重组蛋白”用来指所有通过遗传重组获得的、能用于例如人或动物健康、美容、人或动物营养、农用工业或化学工业等领域的蛋白质、多肽或肽。在这些目标蛋白中，可特别提及的但并非限制的包括：

-细胞因子，特别是白细胞介素、干扰素、组织坏死因子和生长因子特别是造血生长因子(G-CSF,GM-CSF)，激素例如人生长激素或胰岛素，神经肽，

-参与凝血的因子或辅因子，特别是因子Ⅷ、von Willebrand因子、抗凝血酶Ⅲ、蛋白C、凝血酶和蛭素，

-酶，特别是胰蛋白酶、核糖核酸酶和β-半乳糖苷酶，

-酶抑制剂如α1-抗胰蛋白酶和病毒蛋白酶抑制剂，

-能抑制癌的起始或发展的蛋白，如肿瘤抑制基因如P53基因的表达产物，