[发明专利]在原核细胞有控制地表达重组蛋白质的新构建体

权利要求书

1．用于在原核宿主细胞中表达处于Ptrp色氨酸操纵子启动子控制下的目标重组蛋白编码基因的构建体，其特征在于该构建体包含在被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列。

2．根据权利要求1的构建体，其特征在于所述原核宿主细胞是革兰氏阴性细菌。

3．根据权利要求1的构建体，其特征在于所述原核宿主细胞是大肠杆菌。

4．根据权利要求1-3之一的构建体，其特征在于它还在所述当被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列的上游，包含Ptna色氨酸酶操纵子的启动子的全部或部分核酸序列。

5．根据权利要求1-4之一的构建体，其特征在于所述当被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列包含所述TnaA色氨酸酶编码序列的突变片段。

6．根据权利要求5的构建体，其特征在于所述突变片段通过在某个位置插入一个终止密码子来获得，以使由此获得的突变片段的序列编码一个丧失色氨酸酶活性的蛋白片段。

7．根据权利要求5和6的构建体，其特征在于所述突变片段是所述宿主细胞TnaA色氨酸酶编码序列的突变片段。

8．根据权利要求1-4之一的构建体，其特征在于所述当被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列包括含全部或部分启动子序列的核酸序列，该启动子序列3’位置之后是编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的核酸序列。

9．根据权利要求8的构建体，其特征在于在3’位置连接着编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的核酸序列的所述启动子，是大肠杆菌Ptna色氨酸酶操纵子的启动子的全部或一部分。

10．根据权利要求8或9的构建体，其特征在于编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的所述核酸序列，是编码大肠杆菌TrpR色氨酸操纵子阻遏物蛋白的序列或其一个生物学活性片段。

11．含有根据权利要求1-10之一的构建体的载体。

12．根据权利要求11的载体，其特征在于它是载体pMAK705[tnaAt]或载体pMAK705[Ptna::trpR::3’tna]。

13．被权利要求11或12的载体转化的原核宿主细胞。

14．根据权利要求13的原核宿主细胞，其特征在于它是大肠杆菌。

15．使用根据权利要求1-10之一的构建体在宿主细胞中生产目标重组蛋白的方法。

16．根据权利要求15的生产目标重组蛋白方法，其中所述构建体被导入原核宿主细胞的DNA中。

17．根据权利要求15或16的生产目标重组蛋白方法，其中所述构建体通过权利要求11或12的载体被导入原核宿主细胞的DNA中。

18．根据权利要求15-17之一的生产目标重组蛋白方法，其中所述构建体按照实施例1或2所述的染色体整合方法被导入原核宿主细胞的DNA中。

19．根据权利要求15-18之一的生产目标重组蛋白方法，其中导入的所述构建体没有任何赋予与其相关的选择优势的其它DNA元件。

20．根据权利要求15-19之一的生产目标重组蛋白方法，其中所述构建体在大肠杆菌的色氨酸酶操纵子座位导入。

21．根据权利要求15-20之一的生产目标重组蛋白方法，其特征在于它包括如下步骤：

a)用根据权利要求11或12的载体转化原核细胞，并将所述构建体整合至所述宿主细胞的DNA中；

b)用含有所述目标重组蛋白编码基因的载体转化所述原核细胞；

c)在允许重组蛋白表达的培养基中培养所述转化细胞；和

d)从培养基或从所述转化细胞回收重组蛋白。

22．根据权利要求21的生产目标重组蛋白方法，其特征在于所述方法还在步骤a)和b)之间包括分离和筛选步骤。