[发明专利]应用嵌合毒素诊断癌症的方法

说明书

1．简介

本发明涉及运用一种嵌合毒素进行癌症诊断的方法，特别是，本发明涉及运用由促性腺激素释放激素(GnRH)和假单胞菌外毒素A(PE)组成的嵌合毒素检测人腺瘤表达的肿瘤相关表位。以能够结合但不杀死肿瘤细胞的突变GnRH-PE分子例示。

2．发明背景

GnRH是下丘脑神经元产生的十肽，经过门血管分泌到垂体血管循环。首先它作为较大的前体蛋白合成，经过蛋白酶剪切并在其C末端甘氨酸处酰胺化。GnRH刺激垂体前叶腺的促性腺激素细胞释放黄体生成素和促卵泡激素，从而对控制人生殖的下丘脑-垂体生殖腺进行调控。

GnRH牵连到某些癌症中，GnRH类似物用于对乳腺，前列腺，胰腺、子宫内膜及卵巢癌的治疗(Kadar等.，1988，前列腺12:229-307)。这些类似物在体外和体内均可抑制肿瘤细胞生长。此外，在某些实体瘤和建树的细胞系中报道了GnRH结合位点(Emons等.，1993，临床内分泌学代谢，77:1458-1464)，但初步结果暗示参与的GnRH受体(GnRHR)可能区别于以往引证的受体(Kadar等.，1992，《生物化学生物物理研究信息》Biochem.Biophs.Rex.Comm.189:289-295)。

尽管已在肿瘤中证明GnRH结合位点，这些肿瘤主要从激素依赖组织衍生。最近，Nechushtan等报道某些激素非应答肿瘤如结肠癌，肾细胞癌和肝细胞癌易被一种嵌合毒素GnRH-PE致死，(生物化学杂志，1997,272:11597)。GnRH使嵌合毒素结合至GnRHR表达的肿瘤细胞，而PE通过抑制蛋白合成调节细胞杀伤。但是，在本发明之前，并不了解观察到的作用是缘于激素非应答肿瘤的天然GnRHR表达或是由于GnRH-PE识别与GnRH结合的表位不同的新表位。

3．发明概述

本发明涉及用GnRH-RE嵌合毒素检测肿瘤细胞的方法，且GnRH-PE嵌合毒素结合但不杀死肿瘤细胞。特别是，它涉及运用GnRH-PE嵌合毒素检测腺癌表达的表位。本发明的实行中，优选使用经过修饰降低了细胞毒性活性但未改变其对肿瘤细胞结合特异性的GnRH-PE。这样的分子对于在生物样品和患有癌症的被试人中肿瘤细胞的检测尤其有用。

本发明部分基于申请人的如下发现：由GnRH和PE组成的两种突变重组嵌合毒素，称为LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，它们结合但不杀死肿瘤细胞。因为这些嵌合毒素不结合表达可被GnRH识别的天然GnRHR的颗粒肿瘤细胞，所以本发明的嵌合毒素能够识别腺癌表达的新的肿瘤相关表位。

4．附图简述

图1ALGnRH-PE66的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和图1B氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。在突变的嵌合毒素，LGnRH-PE66M中，方框内指定的氨基酸残基#575缺失。

图2LGnRH-PE40的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。方框内指定的氨基酸残基#336在突变的嵌合毒素LGnRH-PE40M中缺失。

图3突变的GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，不表现ADP-核糖基化活性。

图4突变的GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，在293肾癌细胞中不抑制蛋白合成，而未突变的嵌合毒素表现了细胞毒性活性对蛋白合成的抑制用作细胞毒性的指征。

图5GnRH-PE嵌合毒素不抑制表达天然GnRHR的粒膜肿瘤细胞的原始培养物的蛋白合成。

5．发明详述

5.1GnRH-PE嵌合毒素的制备

本发明的GnRH-PE嵌合毒素可通过化学合成方法或在两部分之间化学连接制备，优选通过如下方法制备：在合适的宿主细胞中，在指导事例多核苷酸表达的调节序列控制下，将GnRH的编码序列和PE的编码序列融合(Nechushstan等.，1997，生物化学杂志，272:11597)。两个编码序列的融合可通过分子生物学领域熟知的方法进行。适合在本发明应用的PE编码序列，包括但不仅限于，全长PE，PE的部分片断如PE的结构域Ⅱ和/或Ⅲ，突变的PE，其中结构域Ⅰ的氨基酸残基发生改变降低了非特异的细胞毒性，和具有最小细胞毒活性的突变PE(美国专利号4,892,827,Lorberboum-Galski等，1990，生物化学杂志，265:16311)。