[发明专利]制备阿霉素的方法

说明书

本发明涉及一种通过用重组载体转化的宿主细胞改善柔红霉素至阿霉素转化的方法，所述重组载体包含编码柔红霉素C-14羟化酶的DNA和赋予对蒽环素类抗生素的抗性的基因。

柔红霉素类蒽环素(例如阿霉素、洋红霉素和阿克拉霉素及其合成的类似物)是抗肿瘤疗法中最广泛应用的药剂(F.Arcamone，阿霉素(Doxorubicin),Academic Press New York,1981,pp.12；A.Grein,生化过程(Process Biochem.),16:34,1981；T.Kaneko,Chimicaoggi,1988年5月11日；C.E.Myers等，基于蒽环素和蒽二酮的抗癌剂的“肿瘤细胞杀伤的生化机制”(“Biochemical mechanism of tumour cellkill”in Anthracycline and Anthracenedione-Based Anti-cancerAgents)(Lown,J.W.编辑)，Elsevier Amsterdam,pp.527～569,1988；J.W.Lown,药物疗法(Parmac.Ther.),60:185,1993)。

柔红霉素类蒽环素通常是通过各种链霉菌属(Streptomyces)[波赛链霉菌(S.peucetius)、天蓝微红链霉菌(S.coeruleorubidus)、加利利链霉菌(S.galilaeus)、灰色链霉菌(S.griseus)、灰红链霉菌(S.griseoruber)、标记链霉菌(S.insignis)、绿色产色链霉菌(S.viridochromogenes)、S.bifurcus和链霉菌菌株C5(S.sp.strainC5)]菌株和通过Actinomyces carminata生产的天然化合物。阿霉素主要是通过波赛链霉菌菌株生产的。具体地说，柔红霉素和阿霉素是在波赛链霉菌ATCC 29050和波赛链霉菌青灰亚种(S.peucetiussubsp.caesius)ATCC 27952中生产的。蒽环素阿霉素是由波赛链霉菌27952通过下列文献中概述的方法从丙二酸、丙酸和葡萄糖生产的：Grein,应用微生物学进展(Advan.Applied Microbiol.),32:203,1987以及Eckart和Wagner，基础微生物学杂志(J.BasicMicrobiol.)28:137,1988。阿克醌霉素(11-脱氧-ε-紫红霉酮)、ε-紫红霉酮、紫红霉素D、洋红霉素和柔红霉素都是该过程中产生的中间体。该途径中的最后步骤涉及柔红霉素至阿霉素的C-14羟基化。

用于柔红霉素生物合成的基因是通过克隆试验从波赛链霉菌29050和波赛链霉菌27952获得的(Stutzman-Engwall和Hutchinson,美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:3135,1988；Otten等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)172:3427,1990)。如WO96/27014(公布日期为1996年9月6日)中描述的那样，编码柔红霉素C-14羟化酶(它使柔红霉素转化成阿霉素)的基因是通过克隆试验从波赛链霉菌29050及其突变型获得的，并且，它在链霉菌和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的宿主细胞中被超量表达。

柔红霉素生物合成聚簇的两种基因(drrA和drrB，它们赋予浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)抗阿霉素和柔红霉素的抗性)是从波赛链霉菌ATCC 29050菌株(Guilfoile和Hutchinson，美国国家科学院院报88:8553,1991)(Genbank的入藏登记号为M73758)和从波赛链霉菌7600突变型(EP-0371,112-A和Colombo等，细菌学杂志，174:1641,1992)克隆的。这些基因编码两种翻译上偶联的蛋白质，它们二者都是该宿主中柔红霉素和阿霉素抗性所需的。这两种基因之一的预计产物的序列类似于其它转运基因和抗性基因的产物(最值得注意的是来自哺乳动物肿瘤细胞的P-糖蛋白)。另一种基因drrC(它赋予抗柔红霉素和阿霉素的抗性，与DNA的切除修复中涉及的大肠埃希氏菌和藤黄微球菌(Micrococcus luteus)UvrA蛋白质具有高度的序列相似性)是从波赛链霉菌ATCC 29050克隆的(Lomovskaya等，细菌学杂志178:3238,1996)。