[发明专利]负调控元件的转基因神经特异性表达的应用

说明书

本发明涉及用于控制核酸表达的新方法、构建物以及含有这些构建物的载体。具体讲，本发明涉及用于获得转基因在体内或离体神经细胞中靶向表达的方法、构建物和载体。本发明特别适于体内基因转移的应用，例如在科学研究或治疗方法中。

体内或离体基因治疗是局部有效地转移目标因子的编码基因(转基因)，尤其是在宿主生物的神经系统中。为此，已成功地应用了各种类型的转基因，用于在体内或离体神经细胞中转移不同类型的转基因。特别可举出腺病毒、AAV或HSV类型的病毒载体或阳离子聚合物类型的某些非病毒载体(例如聚乙烯亚胺)。例如这些载体可用于在体内神经系统的细胞中有效稳定地转移转基因(WO94／08026，WO93／09239，WO96／02655)。这种基因转移的实现提供了众多的应用，特别是在医学领域中。例如，这些载体可用于体内或离体基因治疗方法中。对此，现在正在进行关于在神经系统中转移营养因子的多种临床前研究。这些载体还可用于创制转基因动物，用于测试化合物或进行各种标记研究或生物利用度研究。

对于所有这些应用，即使今天看来达到了良好的转移效率和良好的稳定性，但转基因表达的控制还是迫切需要的。对此，已报道了各种系统，试图将转基因的表达仅限制在某些组织中，例如使用所谓的“组织特异性”启动子或复杂的嵌合系统，这需要使用多个构建物和／或调控因子。作为组织特异性启动子的实例，特别可提到胶质细胞原纤维酸性蛋白启动子，其主要在神经胶质细胞中有活性。但这些现有的或经验证的调控系统都有一些缺点，特别是强度和／或选择性不总令人满意。例如，在已知的绝大部分系统中，一般以牺牲启动子的强度来达到选择性，因此难以达到大量、稳定而又特异的表达。

本发明提供可以克服现有技术这些缺陷的方法、构建物及含有这些构建物的载体。具体讲，本发明公开了一种用于神经元靶向表达的嵌合启动子。对此，本发明使用负调控元件，阻止基因在非神经元细胞中的表达。这种构建体与现有技术的系统相比有许多优点。一方面阻遏序列和遍在启动子常较短并已被很好地鉴定，人们容易将其与其他调控元件相连。另一方面，这些调控元件理论上可与无论何种遍在启动子相连，因而是一种灵巧的系统，甚至在所用表达载体在神经细胞中没有或很少有趋向性时，也可以此容易地做到目标转基因的神经特异性表达。

许多研究组报道了抑制神经元基因在非神经元细胞中转录的顺式(cis)序列。具有该特性的一类具体序列由NRSE(神经元限制性沉默元件)构成，也称为RE-1(阻遏元件-1)。NRSE是一种短序列，约21bp，已证明存在于许多神经元基因的上游：例如SCG10[1]、钠通道Ⅱ[2]和突触蛋白Ⅰ[3]。另外，还在许多其他神经元基因的上游发现了类似的序列，但它们的功能迄今并没有被全部阐明[4]。这些NRSE序列通过与仅存在于非神经元细胞中的称为REST(RE-1沉默转录因子)的特异转录因子NRSF蛋白(神经元限制性沉默因子)结合而抑制基因的非神经元表达[5]。该蛋白属于锌指转录因子家族。它在发育过程中出现以启动非神经元细胞中神经元基因的抑制，然后在成人时维持这种抑制。

在神经元基因上游鉴定出NRSE序列存在的研究组已证明，这些序列在转染到非神经元细胞后能够降低报道基因的表达。他们因此将其NRSE序列与最小异源启动子-即可进行基础转录的启动子-相连。例如，钙通道Ⅱ的一拷贝NRSE序列，如置于胸苷激酶启动子上游，降低了报道基因在非神经细胞中的表达达至一半[9]。同样，两拷贝的突触蛋白Ⅰ的NRSE序列与c-fos最小启动子相连可降低75％非神经细胞中的表达[3]。另外，NRSE序列的存在还可以调节非神经元细胞中SV40启动子的活性[10]。

但NRSE序列从没有被用于指导强遍在启动子的表达，也没有被预期用于基因治疗。因此，从未表明这种序列是否能够抑制由强启动子诱导的表达。也没有表明在置于嵌合环境中时这些序列是否在体内总有活性。更一般地讲，与异源启动子组合后这些序列的活性迄今从未在体内得到证明。

本发明涉及用于基因的神经特异性表达的重组核酸。本发明还涉及含有这些核酸的载体，特别是病毒来源的，以及含有这些核酸和／或载体的细胞。本发明还涉及适于体内神经系统中基因的神经特异性表达的特定嵌合启动子。本发明还涉及含有这些元件的组合物及其基因转移的应用。

本发明的第一方面涉及一种重组核酸，其包含：

-一个启动子，

-一个或多个NRSE序列，及

-一种治疗基因。