[发明专利]在酵母中制备目的多肽的方法

说明书

发明领域

本发明涉及在酵母中通过表达融合多肽制备目的多肽的方法，该融合多肽含单碱性氨基酸(monobasic)蛋白酶加工位点。

发明背景

酵母产生许多在细胞内合成但具细胞外功能的蛋白质。这些细胞外蛋白质被称为分泌蛋白。开始时分泌蛋白在细胞内以含前肽序列的前体或前蛋白形式表达，该前肽序列保证表达产物有效定向(进入细胞分泌途径)穿越内质网(ER)膜。该前序列通常被称为信号肽，一般在转位期间从目的产物上断裂掉。一旦已进入分泌途径，蛋白质即被转运至高尔基体。蛋白质从高尔基体分配至质膜、溶酶体和分泌小泡。

已提出数种方法用于酵母异源蛋白质在酵母中的表达和分泌。欧洲公开的专利申请116201号描述了一种方法，通过该方法，由含编码目的蛋白质、前导序列和加工信号之DNA的表达载体所转化的酵母宿主表达、加工和分泌酵母异源蛋白质，制备转化生物的培养物，培养它并从培养基中回收蛋白质，该前导序列是酵母α-因子前导序列。

酿酒酵母MFα1(α-因子)以165个氨基酸的前原(pre-pro)形式合成，含19个氨基酸的信号肽或前肽(prepeptide)，随后是64个氨基酸的前导序列或原肽(propeptide)，包含其后为(LysArg((Asp/Glu)Ala)_2-3α-因子)₄的3个N-连接的糖基化位点(Clements等人，基因，106,1991,pp.267-272)。该文献描述了以改善KEX2加工为目的的KEX2位点的某些修饰。

前原MFα1(pre-pro MFα1)的信号-前导部分已广泛用于在酿酒酵母中获得异源蛋白质的合成及分泌。

欧洲公开的专利申请301669号描述了一种方法，通过该方法，前导序列，尤其是α-因子前导序列指导酵母中所表达的异源多肽的分泌。EP324274公开了通过截短糖基化α-因子前导序列可改进异源多肽的表达和分泌效率。

分泌多肽的进行路线使其暴露于蛋白水解加工系统，该系统切割两连续碱性氨基酸残基羧基端的肽键。酿酒酵母中，该酶促活性由KEX2基因编码(Julius,D.A.等人，基因，37,1884b,pp.1075)。通过KEX2蛋白酶加工产物对于活性酿酒酵母交配因子α1(MFα1或α-因子)的分泌是必需的，而KEX2不参与酿酒酵母交配因子a的分泌。

WO90/10075和WO95/35384描述了KEX2位点周围的修饰。此外，WO95/34666、WO92/11378和WO90/13653描述了在使用KEX2不现实的情况下可选择利用含有称为FXa的氨基酸Ile-Glu-Gly-Arg的次级加工位点。

在应用微生物学生物技术(Applied Microbiological Biotechnology)35(1991)771-776中，Seeboth等人描述了一种机制，通过此机制，在体外用可溶性KEX2加工酵母中的α-前导序列结合多肽(其中通过修饰KEX2基因而将其制成可溶性的)，从而提供了一种增强体外位点特异性加工的方法。在Kjeldsen等人发表于基因，170(1996)107-112的文献中描述了在双碱性氨基酸性(dibasic)KEX2位点之后插入间隔肽，产生多肽前体的N-末端延伸形式，大大促进了KEX2加工并提高了多肽前体的产量。

关于上述方法的一个已认识到的问题是，分泌水平可能会太低或蛋白水解加工可能不正确或不完全，导致目的产物产量较低。

本发明的目的是提供一种可确保目的多肽有高产量的酵母表达方法。

发明概述

本发明涉及通过表达和分泌不含KEX2加工位点的前导序列结合多肽，在酵母中制备目的多肽的方法。前导序列结合多肽包括通过单碱性氨基酸加工位点及可能还有间隔肽连接的天然α-因子前导肽和目的多肽。

更特别的是，本发明涉及通过于合适培养基中培养含能表达具下式序列之表达载体的酵母菌株在酵母内制备目的多肽的方法：

      SP-LP-Xn-PS-^*多肽^*其中SP是信号肽；LP是天然α-因子前导肽或与其至少具85％同源性的前导肽；PS是单碱性氨基酸加工位点Lys或Arg；X是含n个氨基酸的间隔肽；n是0或1-10的整数；和^*多肽^*是目的多肽；