[发明专利]转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌的方法、产品及其应用

说明书

本发明涉及一种含人内皮抑素(Endostatin)基因的具有原核表达元件的质粒通过改进的PEG法、氯化钙法及其它常规基因转导方法转入到乳酸菌类菌株中得到一种转人Endostatin基因乳酸菌，再经继代选择性培养，获得含有人Endostatin基因的具有原核表达元件的基因质粒的转基因乳酸菌，如转人Endostatin基因乳酸杆菌、转人Endostatin基因双歧杆菌和转人Endostatin基因乳酸链球菌，并按不同比例混合制备成转基因乳酸菌类口服制剂——口服液、散剂(包括颗粒剂)、片剂、胶囊或肠溶胶囊，用于治疗血管生成介导性、依赖性或相关性的疾病和治疗内皮细胞过量刺激或异常刺激引起的疾病。

血管生成是指组织器官生长新的血管，并包括内皮细胞增殖。在正常生理条件下，人只是在相当特殊的环境下才涉及血管生成，例如，正常的血管生成一般见于创伤愈合，胎儿和胚胎的发育，黄体、子宫内膜和胎盘的形成。而持续的、未受调节控制的血管内皮细胞异常增殖和血管生成则仅出现于大量病理状态、肿瘤生长和转移以及内皮细胞异常生长疾病中，从而形成血管生成介导性、依赖性或相关性疾病和内皮细胞的过量刺激或异常刺激引起的疾病。这些疾病以往的治疗方法不一，而采用通过抑制内皮细胞的异常增殖这样一种抗血管生成疗法来抑制血管的生成，达到治疗目的这种疗法较少，例如，人实体肿瘤临床上目前常用的手术、化疗、放疗方法，绝大部分是针对肿瘤细胞进行治疗，用抑制剂或阻断剂来抑制或阻断实体肿瘤的血管再生和血液供应方面的这种肿瘤抗血管生成疗法应用较少。

常规基因工程方法一般采用大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、人细胞系作为受体，极少使用乳酸菌类中的乳酸杆菌，双歧杆菌和乳酸链球菌等作为受体。

本发明的目的是改变重组人Endostatin在大肠杆菌中表达纯化得到的针剂剂型方法，通过将含有人Endostatin基因的具有原核表达元件的基因质粒载体，如温控质粒载体pBV220，采用改进的转基因转化方法导入到在人体中既不产生内毒素又不产生外毒素的有益生理菌——乳酸菌类菌株，如乳酸杆菌、双歧杆菌和乳酸链球菌中，从而制备成转人Endostatin基因乳酸菌类口服制剂。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

本发明的方法是以含人外源基因，如人Endostatin基因的具有原核表达元件的基因质粒，如温控质粒pBV220，作为转化载体，以乳酸菌类菌株，如乳酸杆菌、双歧杆菌和乳酸链球菌作为受体，采用溶菌酶处理后的PEG法、氯化钙法及其它基因质粒常规转化方法进行转化处理，再将经转化处理后的转基因乳酸菌类菌株经继代选择性培养，从而获得转人Endostatin基因乳酸菌。

一种转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌的方法，其特征是：

a：按常规方法，将专利申请号为97107112．8中的人Endostatin基因经酶切转移到具有原核表达元件的质粒载体中，对含这种转化载体的基因质粒菌株进行扩增，并从中提取纯化制得含人Endostatin基因的质粒载体；

b：将作为受体的乳酸菌类菌株、如乳酸杆菌、双歧杆菌如乳酸链球菌培养到对数生长期，分别制得便于接受外源基因的乳酸菌类受体。采用适合于原核表达元件的改进的基因质粒转化方法——PEG法、氯化钙法及其它常规转化方法，用a所述的质粒载体对乳酸菌类菌株受体进行转化处理。经上述转化处理的乳酸菌类菌株经复苏培养后，涂布于含有青霉素的常规固体培养基平板上培养48-84小时，然后挑取单菌落培养于常规液体培养基中扩增培养，再扩增培养至继代培养不低于30代。

一种转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌，其特征是有氧培养下的转人Endostatin基因乳酸杆菌和厌氧培养下的转人Endostatin基因双歧杆菌分别扩增培养后，经冻干成菌粉，分别计数活菌数后，以活菌数不同比例混合，可按0-50％的转基因乳酸杆菌和100％-50％的转基因双歧杆菌冻干菌粉混合后，根据最终产品活菌数的要求加入赋型剂脱脂奶粉和1-5％的低聚糖，制备成转基因乳酸菌口服制剂。

一种转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌口服制剂，其特征是用于治疗由血管生成介导性、依赖性或相关性的疾病和过程以及治疗内皮细胞的过量刺激或异常刺激引起的疾病。

以下结合实施例对本发明作进一步说明：