[发明专利]病原菌和疾病相关基因突变诊断专用DNA芯片的检测方法

说明书

本发明涉及一种病原菌和疾病相关基因突变诊断专用DNA芯片的检测方法。

在现有技术中，病原菌的检测主要是利用微生物学方法、血清学方法和PCR方法。如出血性大肠杆菌O157：H7的现有检测方法是：取样品25g，第一天添加新生霉素的mEC培养基225ml(增菌培养)(42℃，18～24小时)；第二天添加SIB琼脂培养基(分离培养基)(35℃，24小时)，并挑选20个以上菌落；第三天添加CLIG琼脂斜面培养基(确认培养)(35℃，18～24小时)进行O157凝聚反应(血清反应)至阳性；第四天进行毒素产生实验，H型别判断。 

疾病相关基因突变的检测主要有(1)PCR-RFLP(restriction fragmentlength polymorphism)，该方法利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切，不同的基因序列将产生不同的电泳图谱(Mercier，B.et al，Eur.J.lmmunogenetics，21，105，1994)。该方法只能应用于当突变改变了某一酶切位点时。该方法的改进是在突变位点引入酶切位点法，即PCR-AIRS(Mut.Res，285，125，1993)。(2)PCR-SSO(sequence specificoligonucleotide)或PCR-ASO(allele specific oligonucleotide)(Cotton，R.G.H.Mut.Res，285，1251993；Saiki，R K et al，Nature，324，163，1986)，待测基因经PCR扩增后，分别与15-20bp标记的野生型和突变型探针杂交。该方法需进行同位素标记或地高辛、生物素、过氧化物酶等标记，分析过程复杂，不适宜快速分析。(3)PCR-SSP(sequence specific primers)或ASPCR(allelespecific PCR)，其原理是根据已知突变位点的性质在引物中设计一错配碱基，使之仅能扩增突变型或野生型基因。该方法较为快速简便。(Wu，D.Y，etal，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，86，2757，1989；Rust，S，etal，Nucleic AcidsResearch，21，3623，1993；Newton，R et al，Nucleic Acids Research，17，2503，1989)。(4)PCR-SSCP(single-stranded conformation polymorphism)，SSCP是指单链DNA分子在中性PAGE中电泳迁移率随其构象改变的性质，因此可作为基因变异的检测方法，最早由Orita用于癌基因点突变和人基因组多态性研究(Orita，M，et al，Proc Natl Acad Sci USA，86，2766，1989)，此法仅能检测基因变异的存在，而不能确定突变的部位和内容。(5)DNA测序法，这是最直观、最准确的方法。但技术复杂价格昂贵，不能作为常规方法。

综上所述，在有关病原菌和疾病相关基因突变诊断的现有技术中，存在操作繁杂，所需时间长，成本较高，难以自动化及大量样本平行分析等问题。

本发明的目的就是针对现有技术的不足，提出一种病原菌和疾病相关基因突变诊断专用DNA芯片的检测方法。

为了达到上述目的本发明采取下列措施：

利用半导体微电子加工技术在玻片上形成中密度(＞2000/microscopeslide)的微金电极阵列，在电极阵列的不同金电极表面用阵列点样仪(Arrayer)和自组装固定技术将不同的DNA探针固定于阵列电极表面。用电极阵列表面的特异性DNA探针杂交方法来检测各种病原菌的特异基因及疾病相关基因突变。杂交过程和杂交区域可以通过电极阵列中不同的电极自由控制。用电化学发光(electrogenerated chemiluminescence，ECL)，电极电化学方法或激光激发荧光扫描方法检测杂交信号。

本发明的优点：

在一显微镜载玻片表面，用半导体微电子加工技术组建10个或更多的区域微电极阵列(10×10)，因此可同时检测多种致病菌及疾病相关基因突变。具有多重分析特点，且每一区域阵列的杂交和检测过程可通过电化学方法独立控制和检测。一种区域阵列用于平行多次检测几种相关基因或一种基因的多种相关突变，同时具有平行分析和多重分析的特点。低电流脉冲加快样品DNA与芯片上固定探针杂交过程，反向低电流脉冲可以区分全配杂交和单碱基失配杂交。电化学发光检测方法，不需要价格昂贵的共聚焦荧光显微镜或荧光扫描仪。致病菌及疾病相关基因突变的检测可缩短至5小时内完成。

下面结合附图和实施例作详细说明：