[发明专利]提高真菌突变体中血红素蛋白产量的方法

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及在真菌中生产血红素蛋白的方法以及能生产血红素蛋白的真菌细胞。

相关技术描述

血红素是原卟啉Ⅸ与铁的螯合复合物，可作为血红素蛋白的辅基(prosthetic group)。原卟啉Ⅸ包含一个卟啉环，该卟啉环具有四个甲基、两个乙烯基和两个丙酸基的取代，获得一个铁原子后形成血红素。由甘氨酸和琥珀酰辅酶A生物合成血红素涉及八个酶促步骤，它们是由5-氨基-γ-酮戊酸合成酶(5-aminolevulinic acid synthase)(EC2.3.1.37)、胆色素原合成酶(EC4.2.1.24)、胆色素原脱氨基酶(EC4.3.1.8)、尿卟啉原Ⅲ合成酶(EC4.2.11.75)、尿卟啉原Ⅲ脱羧酶(EC4.1.1.37)、粪卟啉原Ⅲ氧化酶(EC1.3.3.3)、原卟啉原Ⅸ氧化酶(EC1.3.3.4)以及亚铁螯合酶(EC4.99.1.1)催化的。5-氨基-γ-酮戊酸合成酶催化甘氨酸和琥珀酰辅酶A缩合形成5-氨基-γ-酮戊酸(5-aminolevulinic acid)。胆色素原合成酶(也称为5-氨基-γ-酮戊酸脱水酶)可催化两个分子的5-氨基-γ-酮戊酸缩合形成胆色素原。胆色素原脱氨基酶(也称为羟甲基胆色烷合成酶或uro Ⅰ合成酶)可催化吡咯胆色素原四聚体化形成前尿卟啉原。尿卟啉原Ⅲ合成酶(也称为uro Ⅲ合成酶或uro Ⅲ共合成酶)可催化前尿卟啉原第4个环的重排，随后通过环化形成尿卟啉原Ⅲ。尿卟啉原Ⅲ脱羧酶(也称为uro D或尿卟啉原脱羧酶)可催化尿卟啉原Ⅲ的全部4条乙酸侧链的脱羧反应形成甲基，从而产生粪卟啉原Ⅲ。粪卟啉原Ⅲ氧化酶(也称为粪卟啉原酶)可催化粪卟啉原Ⅲ的A、B环上第2和4位的2个丙酸基发生氧化性脱羧反应形成乙烯基，从而产生原卟啉原Ⅸ。原卟啉原Ⅸ氧化酶可催化原卟啉原Ⅸ发生六电子氧化生成原卟啉Ⅸ。亚铁螯合酶(也称为亚铁裂解酶、血红素合成酶或原血红素亚铁裂解酶)可催化将铁插入到原卟啉中，生成血红素。

血红素的分解代谢涉及两个酶促步骤，它们是由血红素加氧酶(EC1.14.99.3)和胆绿素还原酶(EC1.3.1.24)催化的。血红素加氧酶催化血红素的氧化性裂解，形成胆绿素。胆绿素还原酶在NAD(P)H存在下催化胆绿素还原成胆红素。

脱辅基蛋白质向血红素蛋白的转化依赖于血红素生物合成途径提供的血红素的利用率。血红素蛋白的脱辅基蛋白质形式与血红素结合，形成活性血红素蛋白，其构象使血红素蛋白比脱辅基蛋白质更耐受蛋白水解攻击。若微生物产生的血红素量相比于产生的脱辅基蛋白质量更少，脱辅基蛋白质将累积并发生蛋白水解降解，从而降低活性血红素蛋白的产率。

为克服这一问题，Jensen显示向发酵培养基中添加血红素或含血红素的物质可显著提高米曲霉产生的过氧化物酶产率(WO93/19195)。虽然向发酵培养基中添加血红素可显著提高血红素蛋白的产率，但这种方法有悖常理，花费也大，并且难于大规模应用。

本发明的一个目的是提供可用于提高真菌菌株中血红素蛋白产量的改进方法，以得到商业上有意义的量。

发明概述

本发明涉及生产血红素蛋白的方法，包括：

(a)在适合血红素蛋白生产的培养基中培养亲本真菌细胞的突变体，其中(ⅰ)所述突变体包含一或多个第一核酸序列，该序列中具有对编码一或多种血红素代谢酶的一或多个基因或者其控制序列的修饰，且(ⅱ)在相同条件下培养时，所述突变体相比于亲本细胞生产的所述一或多种血红素代谢酶更少，而血红素蛋白更多；及

(c)从突变细胞的培养基中回收血红素蛋白。

本发明还涉及这样的血红素蛋白生产方法，其中所述突变真菌细胞还包含(ⅰ)指导由真菌细胞内源性的一或多个第二核酸序列编码的一种或多种血红素生物合成酶表达的一或多个第二控制序列，其中该一或多个第二控制序列与第二核酸序列可操作连接；和/或(ⅱ)一或多拷贝的编码一或多种血红素生物合成酶的一或多个第三核酸序列。

本发明还涉及其中突变真菌细胞还包含一或多拷贝的编码血红素蛋白的第四核酸序列的血红素蛋白生产方法。

本发明还涉及用于生产血红素蛋白的突变真菌细胞和所述突变真菌细胞的生产方法。

发明详述

本发明涉及生产血红素蛋白的方法，包括：