[发明专利]3型人副流感病毒的感染性克隆

说明书

本项研究工作得到国立卫生研究院过敏和传染性疾病研究所第32027号补助金的部分资助。政府享有本发明的一些权利。

                             背景

人副流感病毒(HPIV)于1956年被认为是人呼吸道感染的病因，据信它占儿童呼吸道疾病的4-22％，在此方面仅次于呼吸道合胞病毒。HPIV是下呼吸道疾病(如肺炎和细支气管炎)的重要病因，并且是幼儿哮吼的最常见病因。HPIV的四种血清型中3型病毒(HPIV-3)表现出最具毒性，通常在生命的第一个月内引起细支气管炎和肺炎。

不幸的是，目前还没有有效的疫苗或抗病毒治疗可用来预防或治疗HPIV诱导的感染。用来产生灭活病毒的标准方法(如热灭活或化学处理病毒)对于所有HPIV病毒株和血清型(包括HPIV-3型)并不成功。另外，产生减毒病毒的标准方法是在随机位点上产生突变，并且不允许在特定位点修饰HPIV基因组或控制导入基因组的突变数目。

人副流感病毒是有包膜的单链负义RNA病毒，它是副粘病毒科家族副粘病毒属的成员。人副流感病毒基因组(vRNA)的复制与副粘病毒家族的其它成员类似。在感染细胞时，转录是主要的RNA合成行为，结果导致从负义基因组产生病毒mRNA，即vRNA。感染后期，转换到RNA的复制，导致合成全长反基因组正义RNA，作为其它负义基因组RNA合成的模板。基因组RNA的转录和复制依赖于核糖核蛋白复合物(RNP)的形成，该复合物由被核衣壳蛋白(NP)包裹的15462个核苷酸的基因组RNA、和紧密相联的磷蛋白(P)和大的(L)聚合酶蛋白组成。一些宿主细胞因子也参与了HPIV的复制周期。

HPIV需要完整的RNP因而阻碍了无细胞系统中分析HPIV的转录和复制。体外给HPIV-3 vRNA包衣壳的尝试已经失败，与正义RNA病毒不同，裸HPIVvRNA没有感染性。而且，目前没有已知的系统可用来制备重组HPIV，包括重组感染性HPIV-3。

因此，需要有新的试剂、系统和方法使我们得以产生重组HPIV，尤其是重组的有感染性的HPIV-3。允许将一个或多个定点突变导入HPIV(尤其是HPIV-3)基因组中的重组系统是需要的。允许鉴定人副流感病毒RNA转录或复制中定点突变的效果和鉴定导致产生减毒HPIV的定点突变的重组体系统是尤其需要的。

                           发明概述

本发明提供了用于生产重组人副流感病毒、尤其是感染性重组人副流感病毒3型(HPIV-3)的系统。在一个实例中，该系统包含一个克隆，该克隆包含的核苷酸序列编码HPIV的全长正义反基因组；以及至少一个支持克隆(support clone)，该克隆包含编码HPIV P蛋白和HPIV L蛋白的核苷酸序列。在另一个实例中，该系统还包含一个支持克隆，该克隆包含编码HPIV NP蛋白的核苷酸序列。较佳的是，该系统中的每个克隆包含一个RNA聚合酶启动子，它与克隆内所含各个HPIV核苷酸序列操作性相连。

本发明还提供了一个克隆，该克隆包含编码HPIV-3的全长正义反基因组的核苷酸序列。该克隆还包含的RNA聚合酶启动子与HPIV-3反基因组编码序列操作性相连。在一个较佳的实例中，该克隆还包含编码核酶的核苷酸序列，该序列紧靠编码HPIV-3反基因组的序列的下游。

本发明还涉及一种制备重组HPIV-3病毒的方法，在HPIV-3基因组内具有定点突变。该方法包括：制备一个包含修饰的HPIV-3反基因组编码序列的克隆；将修饰的HPIV-3克隆和支持克隆导入宿主细胞，所述支持克隆包含的核苷酸序列编码HPIV-3 P蛋白、HPIV-3 L蛋白，以及较佳的编码HPIV-3 NP蛋白；在允许修饰的HPIV-3反基因组以及HPIV-3的L、P和NP蛋白合成的条件下培养宿主细胞。

产生经基因工程改造而在HPIV-3基因和顺式作用元件内含有定点突变的重组HPIV-3病毒的能力，加快了病毒复制周期的各个方面的研究。另外，能生产经基因工程改造而在HPIV-3基因组内含有定点突变的重组HPIV的系统可用于鉴定减毒副流感病毒基因型和用来开发人副流感病毒活疫苗。

                           附图简述

图1显示了HPIV-3基因组的核苷酸序列的DNA形式，并显示了限制性位点、前导序列、尾随序列、和基因组的蛋白编码区的位置。

图2是pOCU-2^TM载体的限制性图谱。