[发明专利]用于鉴定选择性抑制丙型肝炎病毒复制的试剂的新筛选方法

说明书

本申请要求1997年3月5日提交的美国临时申请流水号60/038,596的权益。1.简介

本发明涉及鉴定抗病毒试剂的新方法，该试剂可选择性干扰病毒蛋白，该病毒蛋白可使干扰素(IFN)诱导的细胞抗病毒感染的防御机制失效。本发明尤其涉及鉴定可选择性抑制含干扰素敏感决定区(ISDR)的病毒蛋白与IFN诱导的PKR蛋白激酶相互作用的试剂的筛选方法。本发明更具体而言涉及鉴定可选择性抑制丙型肝炎病毒(HCV)非结构的5A蛋白(NS5A)(含ISDR)与IFN诱导的PKR蛋白激酶的相互作用的试剂。病毒的ISDR与IFN诱导的PKR蛋白激酶间的相互作用导致IFN-诱导的细胞防御机制对抗病毒感染的失效。因此，采用本发明的方法鉴定的试剂可用作抗病毒剂。2.背景

2.1针对病毒感染治疗的IFN(干扰素)疗法

干扰素为胞外信号蛋白，具多种不同作用，包括免疫刺激，肿瘤抑制，和细胞增殖减少。干扰素诱导宿主细胞中多种基因产物的生产，包括Mx蛋白，2′-5′寡腺苷酸合成酶和RNA酶L.(综述见Sen等，1992，生物化学杂志，267：5017-5020；Sen等，1993，病毒研究进展42：57)。另外，PKR，非cAMP依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶，为一种大于30的IFN诱导的基因产物(Meurs等，1990，细胞62：379-590)。这些蛋白表现出具抗病毒感染的保护作用，因此对IFN治疗病毒感染的有益作用有贡献。

IFN诱导的基因产物提供抗病毒感染的保护作用机制很多。例如，IFN诱导双链RNA依赖酶，2′-5′寡腺苷酸合成酶活化可裂解细胞和病毒RNA的RNA酶，从而钝化病毒复制，如细小核酸核酸病毒复制(Kumar等，1988，病毒杂志，62：3175-3181)。IFN诱导的双链RNA依赖性蛋白激酶抑制病毒和宿主细胞蛋白合成，通过磷酸化和钝化翻译起始因子eIF-2α的一个亚基。IFN也可在病毒生活周期的不同阶段起抑制病毒作用。IFN抑制乙型肝炎病毒颗粒的脱壳，从而抑制病毒复制。IFN抑制疱疹性口腔炎病毒侵入细胞(Whitaker-Dowling等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.美国国家科学院院刊80：1083-1086)。IFN还抑制由病毒，如仙台病毒引起的细胞融合(Tomita等，1981，普通病毒学杂志。55：289-295)。

为抵抗IFN诱导的细胞抵抗机制的有害作用，许多真核病毒发展了阻断IFN诱导的蛋白活性的机制。一些蛋白产生RNA，使IFN诱导宿主细胞翻译关闭无效，例如，腺病毒产生的VAI RNA分子，人免疫缺陷病毒(HIV)TAR区，埃-巴二氏病毒产生的ERER-1RNA分子(Katz等，1987，胚胎杂志，6：689-697；McMillan等，1995，病毒学213：413-424；Carroll等，1993；Beattie等，1995，病毒学210：254-263；Beattie等，1991，病毒学183：419-422)。一些病毒如牛痘病毒K3L蛋白，结合并抑制IFN诱导的PKR蛋白激酶(Gale Jr.等，1996，分子细胞生物学16：4172-4181)。流感病毒，募集细胞因子，如P58结合并阻断PKR蛋白激酶(Lee等，1990，美国国家科学院院刊，87：6208-6212；Lee等，1994，分子细胞生物学，14：2331-2342)。

2.2丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒(HCV)感染是世界性的重要临床问题。仅在美国，就有约4百万人慢性感染HCV。HCV，非甲，非乙肝炎的主要病原体，主要通过血液和血液制品传染(Cathbert等，1994，临床微生物评论杂志，7：505-532；Mansell等，1995，肝病论坛(Semin.Liver.Dis.)15：15-32)。在1990年代中期进行抗HCV筛选之前，HCV占美国输血后肝炎的80-90％。普通应用注射药物是HCV感染的最常见危险因素，占HCV血清反应阳性人群的80％。HCV感染的高几率也可从出血紊乱和慢性肾衰竭的人看出，这些群体常接触血液及血液制品。

HCV的急性感染在约90％病例中导致持久性病毒复制和慢性肝炎进展。对很多病人而言，慢性HCV感染导致进行性的肝损伤和肝硬化的发展。在侵占性感染病人中，肝硬化能在两年中发展起来，尽管更典型的为10-20年时间跨度。30-50％的慢性HCV患者，肝损伤会进一步发展为肝细胞癌。总地说来，肝细胞癌为较晚表现形式，尚需超过30年时间的发展(Bisceglie等，1995，肝病论坛。15：64-69)。决定病情进展的病毒或宿主的相关因子不详。