[发明专利]一种体外构建DNA文库的方法

说明书

本发明的领域

本发明涉及优化DNA序列以(a)通过使用称为基因或DNA改组技术产生“基因”的大容量库人工产生有遗传差异的编码感兴趣蛋白的基因，在适当的表达系统中表达上述基因文库并依据特定特征筛选表达的蛋白以确定表现所需特征的蛋白质，从而改进感兴趣蛋白质的特性或(b)通过产生元件文库，与结构基因可操纵连接后转化适当的宿主，表达上述结构基因并筛选调节元件中的所需特征，从而改进诸如启动子或终止子等调节元件的特性。本发明的背景

在不同属之间，常发现行使特定生物活性的蛋白质表现出一定差异，甚至在同一种的个体间也存在差异。这种差异当然更多的在基因组水平得以表现。

这种编码基本具有相同生物活性蛋白质的基因之间的天然遗传差异是在亿万年中自然产生的，反映了相对于所研究生物体的环境而产生的编码蛋白的自然优化。

在当今社会中，生活环境大大脱离了自然环境并且已经发现在人类将它们用于不同用途特别是用于工业目的是，天然产生的生物活性分子并没有最优化。

因而确认依据所需用途表现最优化特征的那些生物活性蛋白质就成为工业兴趣。

这已经在许多年来通过筛选天然资源，或使用诱变进行。例如，在将酶用于例如洗涤剂的技术领域，通过酶的体外修饰，显著改进了例如天然产生的蛋白酶，脂酶，淀粉酶和纤维素酶的洗衣和/或洗碟应用。

在多数情况下，这些改进是通过定点突变产生依据类型或在成熟酶二级或三级结构中的定位选择的特定氨基酸残基的替代，缺失或插入获得的(参看例如US patent no.4,518,584)。

以这种方式，成功制备了新的多肽变种和突变体，诸如具有改变特性，例如专一活性，底物活性，热，pH和盐稳定性，最适pH，pI，Km，Vmax等的新修饰酶，以获得具有改进特性的多肽。

例如，在酶技术领域，例如蛋白酶，脂酶，淀粉酶和纤维素酶的洗衣和/或洗碟应用得到显著改进。

修饰蛋白质和酶的另一种方法基于随机突变，例如，如US4,894,331和WO93/01285中所述。

由于获得具有改进功能特征的多肽变种或突变体是麻烦和费时的过程，建议了一些快速制备修饰多肽的其它方法。

Weber等(1983)在核酸研究(Nucleic Acids Research)，vol.11，5661中描述了一种通过同源基因间体内重组修饰基因的方法。构建了含有质粒载体并在5’末端侧翼有编码α-1人干扰素的DNA序列，在3’-末端侧翼有编码α-2人干扰素的DNA序列的一段线性DNA序列，并转染到rec A阳性大肠杆菌菌株。使用抗性标记确认和分离重组体。

Pompon等(1989)在Gene 83，p.15-24中描述了一种改组哺乳动物细胞色素P-450基因域的方法，将使用具有补平末端的线性质粒转化酿酒酵母产生的酿酒酵母中的部分同源序列与和上述质粒末端部分同源的DNA片段进行体内重组。

在WO97/07205中描述了一种方法，利用使用质粒性DNA作为模板的体内重组，通过改组同源性DNA序列的不同核苷酸序列制备多肽变体。

美国专利No.5,093,257(Assignee：Genencor Int.Inc.)中公开了一种通过体内重组产生杂合多肽的方法。通过形成含有一个复制序列，编码杂合多肽氨基末端部分的第一段DNA序列，编码上述杂合多肽羧基末端部分的第二段DNA序列的环状载体产生杂合DNA序列。将环状载体转化到rec阳性微生物并在其中扩增环状载体。这样通过rec阳性微生物，包括诸如芽胞杆菌和大肠杆菌等原核生物和诸如酿酒酵母等的真核生物中天然发生的重组机制介导产生了上述环状载体的重组。

Stemmer描述了一种改组同源DNA序列的方法(Stemmer，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol，91，10747-10751；Stemmer，(1994)，Nature，vol.370，389-391)。该方法涉及通过使用体外PCR技术改组同源DNA序列。基于表达蛋白的改进功能从DNA文库中筛选含有改组DNA序列的阳性重组基因。

上述方法亦描述于WO95/22625。WO95/22625涉及一种改组同源DNA序列的方法。WO95/22625中描述方法的一个重经步骤是将同源模板双链多核苷酸切割成所需大小的随机片段，随后将片段同源重装配成全长基因。

然而，WO95/22625中方法的内在缺点是由于使用同源基因序列，通过该方法产生的多样性是有限的(如WO95/22625中所述)。