[发明专利]一种体外构建DNA文库的方法

权利要求书

1.通过在使用聚合酶的体外多核苷酸合成中诱导的模板移位从一系列不同的起始单或双链亲代DNA模板和引物构建重组同源多核苷酸文库的一种方法，其中A.通过下面方法合成延伸引物或多核苷酸

a)将亲代双链DNA模板变性产生单链模板，

b)将上述引物与单链DNA模板退火，

c)使用上述聚合酶通过起始合成延伸上述引物，

d)引起合成的抑制，并

e)将双链变性，从模板分离延伸的引物，B.通过下面方法诱异模板移位    

a)从模板分离新合成的单链延伸引物并使用(A)中产生的上述延伸引物

作为引物和模板重复步骤A.b)至A.e)，或

b)重复步骤A.b)至A.e)，C.在适当数目循环的步骤A.和B.a)，A.和B.b)，或其组合后终止上述过  程，并且D.可选择地使用特定引物在标准PCR反应中扩增产生的多核苷酸以选择性  扩增感兴趣的同源多核苷酸。

2.权利要求1所述的方法，其中上述聚合酶是热稳定DNA聚合酶，诸如Taq，Amplitaq，Vent，Pwo。

3.权利要求1所述的方法，其中上述聚合酶是一种DNA聚合酶，诸如T4聚合酶，T7聚合酶，大肠杆菌聚合酶I或DNA聚合酶I的Klenow片段，并且在每一循环后将上述聚合酶加入反应混合物。

4.权利要求1所述的方法，其中上述聚合酶是一种RNA聚合酶。

5.权利要求1至4的任一个所述的方法，其中上述聚合酶是一种易出错聚合酶，诸如反转录酶例如HIV反转录酶。

6.权利要求1至5的任一个所述的方法，其中上述起始单或双链亲本模板是不同的，它们在相同天然多核苷酸(基因)上含不同点突变，或是从天然分离的同源多核苷酸(基因)。

7.权利要求6所述的方法，其中上述起始单或双链亲本模板在DNA水平显示例如超过95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或甚至超过50％的相同性。

8.权利要求1至7中任一个所述的方法，其中通过升高温度抑制在步骤Ad)中的聚合酶反应。

9.权利要求8所述的方法，其中温度升至90℃和99℃之间的某值，优选地94℃。

10.权利要求1至7中任一个所述的方法，其中在步骤1.d中聚合酶反应的抑制是通过加入特定试剂，如DMSO达到的。

11.权利要求1至10中任一个所述的方法，其中上述引物包括一组完全随机引物。

12.权利要求1至10中任一个所述的方法，其中上述引物包括一组半随机引物。

13.权利要求1至10中任一个所述的方法，其中上述引物包括一组特定引物。

14.权利要求1至13中任一个所述的方法，其中上述引物是标记的，优选地用生物素或地高辛配基标记。

15.权利要求11，12或14中任一个所述的方法，其中上述随机或半随机引物具有6至500bp的长度，优选地15至300bp，更优选地25至150bp。

16.权利要求13或14所述的方法，其中上述引物长6至75bp。

17.权利要求1至16中任一个所述的方法，其中上述起始亲本DNA模板至少50％，60％，70％，80％，90％，或95％同源。

18.权利要求17所述的方法，其中上述起始亲本DNA模板来自不同属的野生型有机体。

19.权利要求17或18所述的方法，其中上述起始亲本模板长度大约50bp至20kb，优选地大约100bp至10kb，更优选地200bp至7kb，特别优选地大约400bp至2kb。

20.权利要求1至19中任一个所述的方法，其中上述起始亲本模板是由PCR反应产生的线性DNA片段。

21.权利要求1至20中任一个所述的方法，其中将上述起始亲本模板克隆到适当的载体，如质粒。