[发明专利]用于制备核黄素的单细胞或多细胞生物体

说明书

本发明涉及一种用于借助微生物制备核黄素的单细胞或多细胞生物体。

维生素B₂，也被称为核黄素，是人体和动物体必需的。在缺乏维生素B₂时，会出现口腔粘膜和咽粘膜发炎，口角开裂，皮肤褶皱处瘙痒和发炎以及皮肤损伤，结膜炎，减弱的视觉锐度和角膜浊度。对于婴儿和儿童可能出现生长停止和体重减轻。因此，维生素B₂特别是作为维生素缺乏时的维生素制剂以及作为饲料添加剂在经济上具有意义。此外，它同样可以作为食品染料，特别是在蛋黄酱、冰淇淋和布丁等中使用。

核黄素的制备或者按照化学或者按照微生物方法进行。在化学制备方法中，一般在多步骤工序中核黄素作为纯的最终产物获得，然而其中同样必须使用相对昂贵的原料如D-核糖。因此，考虑核黄素的化学合成仅用于这样的应用目的，例如在人类医学，这对于纯的核黄素是必需的。

除核黄素的化学制备方法外的其它方法是通过微生物制备该物质。核黄素的微生物制备方法特别适合于这种情况，即其中不需要该物质具有高的纯度。此外，另一种情况是当核黄素作为添加剂被用于饲料产品中。在这种情况下，核黄素的微生物制备方法的优点在于，在一步工序中即可获得该物质。同样可以使用生长的原始材料例如植物油作为微生物合成的原材料。

通过真菌如或假囊酵母属的发酵制备核黄素是已知的(The MerckIndex,Windholz等,eds.Merck&Co.,1183页，1983,A.Bacher,F.Lingens,Augen.Chem.1969,393页)；但是酵母，如念珠菌属或酵母菌属，和细菌如梭状芽孢杆菌属也适合于核黄素制备。

此外，例如在US05231007中描述了借助于酵母famata念珠菌属的制备方法。

核黄素过量生产的菌株例如描述在EP405370、GB1434299、DE3420310和EP0821063中，其中通过核黄素生物合成基因的转变由枯草杆菌获得该菌株。但是原核基因不适合于用真核细胞如啤酒糖酵母或棉桃阿舒氏囊霉菌属制备重组体的核黄素的方法。因此，根据WO93/03183，从真核细胞，即从啤酒糖酵母中分离出用于核黄素生物合成的特异基因，以便为在真核细胞的生产性生物体中核黄素的重组体制备作好制备。然而，当不能充分对特定的参与核黄素生物合成的酶提供底物时，对于核黄素的生产，该重组体制备方法没有或只获得有限的成功。

1967年Hanson(HansonAM,1967，在《微生物技术》中，Peppler,HJ,222-250页，纽约)发现，加入氨基酸甘氨酸可以调节棉桃阿舒氏囊霉菌属的核黄素的形成。然而，该方法存在缺陷，因为甘氨酸是一种非常昂贵的原材料。基于该理由，人们致力于通过突变的产生来使核黄素的生产达到最佳化。

由德国专利说明书19525281已知一种制备核黄素的方法，其中温育微生物，它对阻碍异柠檬酸酯裂解酶的活性物质有抵抗作用。

由德国专利公开说明书19545468.5-41已知另一种微生物制备核黄素的方法，其中产生的微生物提高了核黄素的异柠檬酸酯裂解酶的活性或异柠檬酸酯的基因表达。但是，同样与该方法相比，仍然需要进一步使核黄素的制备达到最佳化。

因此，本发明的目的是提供一种用于核黄素微生物制备的单核或多核有机体，优选微生物体，它们使核黄素形成的进一步最佳化成为可能。特别地，应该提供一种生物体，其在节约原材料的条件下适合于制备核黄素，并因此使生产成为可能，与迄今为止的现有技术相比，它是经济的。首先该生物体与到目前为止的生物体相比应该使核黄素的加快形成成为可能，而无需添加甘氨酸。

本发明的目的是通过单核细胞或多核细胞生物体解决的，该生物体具有这样改变的甘氨酸物质代谢，以致在无外加的甘氨酸下它的核黄素合成效率至少是与野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895的核黄素合成效率相同，其中野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895是在标准条件下在加入6克/升的额外的甘氨酸下培养的。

在标准条件下的培养是指在120RpM和30℃下，在500毫升具有二块挡板的振动式烧瓶中进行温育。每个烧瓶中使用的介质是50毫升的或者具有10克/升葡萄糖或者具有10克/升大豆油的10克/升的酵母抽提物的溶液。在相同的条件下采用1％的16h培养物进行接种。