[发明专利]RNA循环逆转录反应方法

说明书

本发明属生物工程技术领域，是一种逆转录(Reverse Transcription，RT)反应方法，可由一份RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)模板循环逆转录得到多倍份的cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互补DNA)的反应方法。

现行的RT方法，只能得到与RNA模板相同拷贝数的cDNA产物。要有效分离低丰度mRNA的cDNA克隆，必须先采取一些非常复杂的方法进行富集。由于样品来源往往稀少而珍贵，富集工作不仅繁琐，而且很不经济。另一方面，常规RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链反应)扩增有时也难以对这样微量的RNA样品进行检测。虽然采用NP-PCR的方法(Nested Primers-PCR，巢式PCR)，能够进一步提高检测的灵敏度。然而，其缺点也是很明显的：首先从技术基础上看，由于需要使用了4-5个特异引物(包括逆转录引物和外内引物对)，不仅增加了引物设计上的难度，而且不能应用于包含随机引物的PCR扩增如差异展示PCR(Difference Display PCR，DD-PCR)；再者，由于PCR扩增量呈指数增加，连续2重PCR扩增使得对RNA进行定量分析很困难；第三，操作需要进行1-2次转移，繁琐易导致发生污染；最后，成本较高，接近普通RT-PCR的2倍。

本发明的目的在于提供一种操作简便，且能大量提高cDNA产物量的逆转录反应方法。本发明是由一份RNA模板循环逆转录得到多倍份的cDNA的反应方法，具体是将反应体系置于热循环仪上进行如下步骤的循环反应：

1．变性，即对待扩增的RNA模板加热变性，温度条件：89～95℃，保温定时间(5～120秒)；

2．复性，即RT引物(用于RT过程中，与RNA链结合并能引导cDNA合成的DNA寡核苷酸)与RNA链上的互补序列结合复性，温度条件：55～68℃，保温一定时间(5～90秒)

3．延伸，即逆转录酶催化RT引物延伸合成cDNA，形成RNA-DNA杂合双链，温度条件：60～70℃，保温一定时间(60～180秒)；

杂合双链变性解链后，RT引物再结合到RNA链上，由逆转录酶第二次催化引物延伸合成cDNA，如此，利用RNA模板，可以反复进行cDNA合成，因而，称之为循环逆转录(Cycle Reverse Transcription，CRT)。每一次变性-复性-延伸的过程，就是一次循环逆转录的循环。由于逆转录是单个逆转录引物的单向延伸过程，循环逆转录导致的cDNA的量增加呈线性增长。因此，循环逆转录过程可以很方便地用于对RNA的定量PCR分析。为了方便操作，循环逆转录使用(但不限定)在高温下具有逆转录催化活性的DNA聚合酶，如：FD酶、Tth酶等，并且根据需要，可以偶联PCR反应。

本发明提出的CRT反应体系(20μl)如下：

Tris-HCl pH 7.9-9.1，10-50mmol/L；(NH₄)₂SO₄5.0-25mmol/L；MnCl₂1.0-5.0mmol/L；dNTP0.2-2.0mmol/L；DTT0.5-5.0mmol/L；明胶0.05-0.5mg/ml；RT引物0.5-2.0μmol/L；FD酶(或Tth酶)0.5-3U；RNA模板。

上述体系混匀后，以液蜡封住液面，在热循环仪上设置上述温度程序，进行CRT反应。如需继续进行PCR扩增，则只需再向该体系中加入终浓度为0.2-2.0μmol/L的一对PCR引物，继续在热循环仪上进行PCR反应。结果检测同一般的PCR结果检测方法。

本发明的优点

CRT包含变性过程，可以破坏RNA的二级和三级结构，有利于RT的进行。CRT反复利用RNA模板合成cDNA，提高了RT对RNA模板的利用效率，在不增加成本花费的情况下，使得cDNA产物量增加几十倍。这样，有利于对低丰度RNA的检测和分析，有利于研究低表达的基因和发现新基因。

CRT可以如同普通RT一样直接偶联PCR，能够有效地提高RT-PCR对RNA检测的灵敏度。与提高RT-PCR灵敏度的常用方法NP-PCR比较，更具有以下优点：

1．技术设计简单易行。NP-PCR由于需要使用多重特异引物，技术设计要求高；而CRT-PCR不需要多重特异引物，技术设计要求比较简单。