[发明专利]单体胰岛素的制备方法

说明书

本发明为单体胰岛素的制备方法。胰岛素是治疗糖尿病的特效药，它用于临床已有70多年。但是现在临床用胰岛素制剂的主要问题之一，是在控制患者血糖的时相方面，不能模仿生理胰岛素的功能。正常人，进餐后30-60分钟，血胰岛素浓度达高峰，4-5小时后恢复到基础浓度水平，这与人进餐后血糖时相一致(Schade,D.S.,et al.,Diabetes Care,1980,3:9)。而皮下注射胰岛素制剂后，血胰岛素浓度缓慢上升，90-120分钟后只达到比较低的峰值，之后又不能快速降低(Home,P.D.,et al.,Metabolism,1981,30:439)，从而使患者血糖处于非生理周期状态。其主要原因是由于药剂浓度的胰岛素六聚体的形式存在(Blundall,T.,et al.,Adv.Protein Chem.,1972,26:279；Drejer,K.,Diabetes/Metabolism Reviews,1992,8:259)，而胰岛素在体内的作用，首先是以单体形式与其专一受体结合，最终表现其生理功能(Blundall,T.,etal.,Adv.Protein Chem.,1972,26:279；Insulin Research Group,AcademiaSinica,Sci.Sin.,1974,17:779)。注射药剂胰岛素后，由六聚体转变为二聚体，再变为单体，需要比较长的时间，导致作用缓慢。如果注射的胰岛素为单体胰岛素，则可直接发挥作用，从而克服了普通药剂胰岛素作用缓慢的缺点。因此，获得可用于临床的单体速效胰岛素，是目前胰岛素蛋白质工程研究的主要目标之一。目前常用的获得单体胰岛素的方法是通过基因定点突变，向胰岛素分子的二聚体形成面引入具有电荷或侧链很大的的氨基酸残基，以阻碍二聚体的形成，以获得单体胰岛素(Brange,J.,et al.,Nature,1988,333:679；Kang,S.,et al.,Lancet,1990,335:303；刘滨等，生物化学与生物物理学报，1996,38:245)。所获得的单体胰岛素都含有突变残基(王琼庆等，生物化学与生物物理进展，1996,23:402)。

B链羧端去五肽胰岛素(DPI)是以单体形式存在的(中国科学院上海生物化学胰岛素组，中国科学，1976(4),429)，且保留较高的胰岛素活性(InsulinResearch Group,Academia Sinica,Sci.Sin.,1974,17:779)。为获得可用于临床的重组DPI，我们将胰岛素单链前体(PIP)基因(Zhang,You-Shang,etal.,Science in China(Series C),1996,39:225)B29位的Lys密码子改变为Thr密码子，得到含有MIP基因的质粒并在酿酒酵酵母中进行分泌表达。进而以纯化的MIP和化学合成的三肽Gly-Phe-Phe或四肽Gly-Phe-Phe-Tyr(OBut)₂为底物，通过胰蛋白酶酶促转肽获得重组DPI或DTI。MIP与三肽或四肽的反应部位为MIP B22位Arg的羧基。重组DPI和DTI是不含突变残基的天然的单体速效胰岛素。

本发明是在酵母中分泌表达单体胰岛素前体(MIP)并通过酶促转肽获得的单体胰岛素(DPI,DTI及其它单体胰岛素)，其特征如下：

a．用基因定点突变方法，将胰岛素单链前体(PIP)基因中的B29Lys密码子改变为Lys和Arg以外任一氨基酸的密码子，得到MIP表达质粒pZW[B29Thr]PIP。

b．用质粒pZW[B29Thr]PIP转化酿酒酵母Saccharomycescerevisiae(XV-700-6B)而获得工程菌株YS98。

c．分泌表达产物MIP经分离纯化后通过酶促转肽转化为DPI,DTI及其它单体胰岛素。

本发明的技术特征在下述的实施例中作具体描述。

名词解释：

MIP：单体胰岛素前体

PIP：胰岛素单链前体

DTI：B链羧端去四肽胰岛素

DPI：B链羧端去五肽胰岛素

DOI：B链羧端去八肽胰岛素

本发明的附图说明如下：

图1突变序列的测定

    箭头所指可见AGG已突变为ACC

图2 MIP的Sephadex G-50(2.5×160cm)洗脱图谱

    图中阴影部分为放免活性区。

图3 pH8.3聚丙烯酰胺不连续电泳

    从左至右依次为：