[发明专利]生产植酸酶的方法

说明书

本发明涉及生产植酸酶的方法，以及涉及该方法中使用的重组载体和转化体。

植酸酶是将植酸钙镁水解产生磷酸盐的酶。近几年来，试图通过向家畜的饲料中加入植酸酶添加剂以便分解植酸钙镁而降低家畜粪便的磷酸盐水平，从而有效地利用饲料中的磷酸盐，而所述植酸钙镁不能被单胃动物例如鸡和猪所消化。

EP-A-0699762公开了来源于西方喜旺氏酵母的植酸酶和编码该植酸酶基因。该植酸酶可以水解植酸为肌醇并且具有极好的热稳定性。因此，由于植酸酶几乎不被失活，甚至在饲料的制备过程中当饲料中含有的植酸酶暴露于高温时也不失活，该植酸酶在工业上是有用的。    

EP-A-699762公开了利用啤酒酵母转化体生产植酸酶的方法。但是，就植酸酶的分泌生产而言可以进一步改进该方法。

顺便提及，在利用重组微生物生产重组蛋白质的过程中，通过制备分泌重组蛋白到细胞外的重组微生物细胞而生产重组蛋白质是令人满意的，因为反馈调节很可能被关闭了，所生产的重组蛋白质很可能不会被分解，所以可以以活性形式被回收，所获得的重组蛋白质的纯化是容易的。

另一方面，为了稳定地生产重组蛋白质，优选的重组微生物是酵母，因为酵母易于培养，而且可以将编码重组蛋白质(将其基因导入到酵母中)的基因导入到酵母的染色体中。因此，已经对利用重组酵母分泌生产重组蛋白质进行了研究。但是，由酵母分泌生产重组蛋白质，尤其是当重组蛋白质来源于酵母以外的种时，分泌生产效率低于由细菌例如枯草芽孢杆菌的生产效率。

涉及高产量分泌生产重组蛋白质的参考文献包括EP-A-0558024,EP-A-0794256和Y.Sakai等人，Biochim.Biophys.Acta第1308期，第81-87页(1996)。

EP-A-0558024公开了包括博伊丁氏假丝酵母的醇氧化酶(AOD)基因的启动子和终止子的表达盒；具有该表达盒的表达载体，和具有表达载体的转化酵母。尤其是该专利申请公开了利用该表达盒表达腺苷酸激酶，细胞色素C552和过氧化物酶。

在EP-A-0794256中，制备了具有重组质粒的转化酵母(博伊丁氏假丝酵母)，所述重组质粒是通过将编码来自于啤酒酵母Kex2蛋白酶的多肽的基因插入到上文提到的表达载体获得的，通过向培养转化酵母细胞的液体培养基中加入甲醇的同时培养转化酵母生产来自于啤酒酵母Kex2蛋白酶的多肽。

Sakai等人通过加入甲醇，甘油和浓缩的培养基成分，培养同化甲醇的博伊丁氏假丝酵母的转化体而生产来自于米根霉的葡萄糖淀粉酶，从而积累葡萄糖淀粉酶到3.4克/升的水平。

在这些已知的过程中，虽然大量地生产所需的蛋白质或多肽，随着所需产物的产生，微生物细胞的量也增加。这意味着每单位量微生物细胞的生产效率随时间而降低，所以该生产方法不是有效的。

此外，本发明的发明人发现博伊丁氏假丝酵母将各种各样的粘性多糖分泌到细胞外。由于在培养期间酵母细胞的浓度增加，由酵母细胞分泌的多糖积累到培养基中，所以培养基的粘性增加。因此，给酵母细胞供应足够氧气带来困难，所以不能很好地生产所需的重组蛋白质。

此外，如果微生物细胞增加太多，所需产物的纯化是困难的，增加了处理废弃细胞的成本。因此，在工业生产过程中，微生物细胞的数量增加太多不是令人满意的。

因此，研制加料分批培养方法是令人满意的，其中当将微生物生长限制到一定的程度，可长时间稳定地和连续地，有效地生产所需产物。但是，对于利用酵母分泌生产重组蛋白质，这样的一种加料分批培养方法是未知的。对于其中重组蛋白质是植酸酶的分泌生产方法是完全未知的。

                         发明概述

因此，本发明的一个目的是提供用于分泌生产植酸酶的新的和有效的方法，该方法包括在液体培养基中培养重组博伊丁氏假丝酵母以便使酵母细胞连续地分泌植酸酶，并且基本上没有增加酵母细胞的量。

本发明人进行了广泛的研究发现通过在一定量的磷酸或磷酸盐化合物存在下，培养含有重组载体的博伊丁氏假丝酵母转化体细胞，所述载体具有甲醇诱导型启动子，和启动子下游的编码植酸酶的基因，其中磷酸或磷酸盐的量限制酵母的生长，在基本上没有增加细胞量的情况下由细胞分泌植酸酶，从而完成本发明。