[发明专利]表达可被蛋白酶激活的活性物质的核酸构建体和其制备方法及用途

说明书

本发明涉及一种表达可以被蛋白酶激活的活性物质的核酸构建体，其制备方法和用途。

类似炎症的区域，肿瘤可以通过实质上增加蛋白酶的形成和分泌与周围的正常组织相区别[Schmitt等，Fibrinol.6，3(1992)，Cottam等，Int.J.Oncol.2，861(1993)，Tryggvason等，乳腺癌研究与治疗.24，209(1993)，Leto等，抗癌研究.12，235(1992)，Hart，Fibrinol.6，11(1992)，Albini等，J.Natl.Cancer Inst.83，735(1991)]这些蛋白酶的例子是纤溶酶原激活物、组织蛋白酶和基质金属蛋白酶。

这些肿瘤蛋白酶的必需功能是溶解胞外基质，使得肿瘤细胞可以侵入正常组织并以渗透性方式在其中生长。这些蛋白酶保护肿瘤使之不受身体防御机制的作用，因为防御所需的活性化合物被肿瘤形成的蛋白酶切割进而失活。这样，例如，抗体，细胞因子和生长因子，补体因子，凝固因子和调节物可以被肿瘤蛋白酶灭活。

因此，过去的目标是通过抑制肿瘤细胞蛋白酶来抑制肿瘤的渗透性生长与转移性生长以及灭活身体的防御机制[Hocman，国际生物化学杂志.24，1365(1992)，Troll等，JNCI 73，1245(1984)，Ray等，Eur.Respir.2，2062(1994)，Koop等，癌症研究.54，4791(1994)，Chiriri等，国际癌杂志58，460(1994)，Denhardt等，59，329(1993)，Melchiori等，癌症研究.52，2353(1992)]。然而，特别是由于化学计量和药物动力学上的原因，以前在抑制肿瘤细胞蛋白酶上很少取得成功。

因此尝试进行了利用肿瘤细胞蛋白酶激活细菌毒素如金黄色葡萄球菌α-溶血素[Panchal等，Nature Biotechn，14，852(1996)]。为此，将一种氨基酸序列(即XX-Arg-X)插入到α-溶血素的129至132位中，以这种方式产生非活性突变体，其仅被肿瘤蛋白酶(如组织蛋白酶B)切割，进而被激活。

基于这些结果，提出了免疫溶素原(proimmunolysins)[Panchal等，Nature Biotechn，14，852(1996)]，这些免疫溶素原包括抗体，其连接到金黄色葡萄球菌α-溶血素(可以由肿瘤蛋白酶激活)或海葵equinatoxinII上，用抗体测定连接产物的靶细胞特异性。

然而，就其在肿瘤治疗中的用途而言，所提出的概念具有下列缺点：

首先，作者选择xenogeneic nonendogenous溶素和/或毒素，其对宿主有机体(患者)是免疫原性的，结果在宿主有机体中引起免疫反应，这一免疫反应中和和灭活抗体/毒素缀合物。

第二，已知[Sedlacek等，作为细胞毒性载体的抗体.Contrib.toOncol.43，Karger Verlag，慕尼黑，1992]由于它们的分子大小和在肿瘤上的流变学条件，肿瘤-特异性抗体和免疫毒素在肿瘤上仅以极小的量(0.01-0.001％给定的抗体或免疫毒素/g肿瘤)产生，或者仅仅渗透到肿瘤不完全的程度，由此，其要么不可能消灭所有的肿瘤细胞，要么仅可能消灭一小部分肿瘤细胞。此外，肿瘤抗原的程度(抗体所针对的抗原)通常在个体肿瘤细胞之间的表达是不同的和可变的，抗原-阴性肿瘤细胞容易逃避抗体或免疫毒素的进攻。除此之外，肿瘤细胞分泌的抗原中和肿瘤外周的抗体(Sedlacek等，肿瘤疗法的单克隆抗体，Contrib.to Oncol.，Karger Verlag，1988)。

因而，仍然非常需要对肿瘤和炎症的靶细胞-特异性疗法。因此，本发明的目的是提供针对肿瘤和炎症的活性化合物，这种活性化合物不显示出所说的缺点。因此，本发明涉及使用肿瘤或炎症区域中分泌的酶以获得活性化合物(其非活性前体在肿瘤细胞、肿瘤-相关细胞或炎性细胞中表达)的局部释放的新技术。

因此，本发明的主题的一部分是表达活性物质的核酸构建体，该活性物质被哺乳动物细胞释放的酶激活，这种活性物质包括下列组分：

a)至少一个启动子元件，

b)至少一种编码活性化合物(蛋白质B)的DNA序列，

c)至少一种编码一种氨基酸序列(部分结构C)的DNA序列，所说的氨基酸序列可以被从哺乳动物细胞释放的酶特异性地切割，和

d)至少一种编码一种肽或蛋白质(部分结构D)的DNA序列，所说的肽或蛋白质利用可切割的氨基酸序列(部分结构C)连接到活性化合物(蛋白质B)上并抑制活性化合物(蛋白质B)的活性。