[发明专利]来自绿色木霉的纤维素酶cbh1基因的调控序列以及利用该序列的蛋白质或多肽的大量生产体系

说明书

本发明涉及蛋白质或多肽的大量生产体系，更详细地说是涉及利用了来自绿色木霉Trichoderma viride的调控序列的生产体系，以及利用了该生产体系的蛋白质或多肽的生产技术。

霉菌能够向菌体外大量分泌蛋白质、特别是分泌酶已为人们所知。例如，Aspergillus属真菌能够分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶，这些酶被用于各个领域。其生产量，就工业上利用黑曲霉Aspergillus niger情况看，每升培养液生产的葡萄糖淀粉酶在20g以上，而利用米曲霉Aspergillus oryzae生产时，通过个体培养每1kg大约生产50kg左右(五味胜也：化学与生物(1994),32,269)。

近年来，关于利用霉菌生产蛋白质的特性生产目的蛋白质的技术也正在积累着很多的知识。例如，可以通过下列各种宿主菌生产来自霉菌的异种蛋白质：以Aspergillus nidulans为宿主菌生产来自Mucor miehei的凝乳酶(G.L.Gray，等：基因(Gene)(1986),48,41)、以Aspergillus niger为宿主菌生产来自Aspergillus ficuum的植酸酶(R.E.M.van gorcom等：欧州专利申请(1991),0420358A1)、以Aspergillus oryzae为宿主菌生产来自Mucor miehei的凝乳酶(T.christensen，等：生物/技术(Bio/Technology(1988),6,1419)和脂肪酶(B.huge-Jensen，等：脂(Lipids)(1989),24,781)、以Trichoderma reesei为宿主菌生产来自Phlebia radiata的漆酶(M.Saloheimo，等：生物/技术(Bio/Technology)(1991),9,987)、以Trichoderma viride为宿主菌生产来自Aspergillus oryzae的α-淀粉酶(C.Cheng，等；农业生物化学(Agric.Biol.Chem),(1991),55,1817)、以Acremonium chrysogenum为宿主菌生产来自Fusarium属的碱性蛋白酶(森田滋等：日本农艺化学会大会讲演要旨集(1993),p.140)。另外，以Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae或Trichoderma reesai为宿主菌生产来自人或马等动物的蛋白质、甚至于生产来自植物的蛋白质也已得到了证实。

如上所述，很清楚霉菌是蛋白质或多肽的优良的生产宿主菌。而且工业上利用这些宿主菌时，目的蛋白质的产率变得重要了。作为所谓左右蛋白质产率的要素有以下几点：①在宿主内表达的调节区域(例如启动子或终止子等)应对有效、且大量转录、翻译目的蛋白质进行调节，②翻译产物应呈现出表现活性的高级结构(活性型)，③而且翻译产物应稳定地分泌到细胞外等。对此，已经开发出了Aspergillus属的淀粉酶基因启动子以及Trichoderma属的纤维素酶基因启动子等有效的启动子。如果按照到目前为止的看法，以Aspergillus oryzae为宿主菌，利用α-淀粉酶的启动子，每升培养液可以生产3.3g的Mucor miehei的凝乳酶。

然而，无论利用多么强的启动子，一般来说希望得到的目的蛋白质也不会超过宿主的蛋白质的产量。实际上，就上述Aspergillus oryzae的例子来说，只不过利用了30％的蛋白质生产能力。人们认为这种现象是利用的基因遗留在宿主中，翻译区的密码使用频率因菌种不同而产生的差异，分泌的机制因菌种不同而产生的差异等因素造成的，然而改进这些因素的技术还未见报道。

因此，应当考虑通过使宿主的蛋白质产量本身提高，来使目的蛋白质的收率提高。