[发明专利]通过连接经编码的衔接子进行测序

说明书

                         发明领域

本发明一般地涉及测定多核苷酸的核苷酸序列的方法，更具体地涉及通过经编码的衔接子的特异性连接鉴定多核苷酸的末端核苷酸的方法。

                           背景

几乎所有被选择用于科研和商业的DNA测序法都基于由Sanger开创的双脱氧链终止法，如Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，74：5463-5467(1977)。已由几个途径入手改良了此方法，多种形式的此方法已被用于所有商用的DNA测序仪中，如Hunkapiller等，科学，254：59-67(1991)。

链终止法需要产生一套或多套经标记的DNA片段，每套片段具有相同的来源，以已知的碱基终止，然后必需通过大小分离一套或多套片段以得到序列资料。通常通过高分辨率的凝胶电泳来完成大小分离，所述凝胶电泳必需具有区分大小差异仅为1个核苷酸的很大的片段的能力。尽管已作了显著改良，如使用毛细管阵列进行分离和使用了非-凝胶电泳分离介质，但此技术仍不能使其自身小型化或大规模地平行实施。

已研究出的几种所谓的“一个碱基一个碱基地”或“单个碱基地”测序方法可替代基于Sanger法的DNA测序法，如Cheeseman，美国专利5,302,509；Tsien等，国际申请WO91/06678；Rosenthal等，国际申请WO93/21340；Canard等，基因，148：1-6(1994)；和Metzker等，核酸研究，22：4259-4267(1994)。这些方法的特征在于：每个化学或生物化学操作循环测定一个核苷酸，而不需要分离步骤，因此，如果它们能按预想的那样完成，“一个碱基一个碱基地”测序法保证能对结合在微粒或固相阵列上的靶多核苷酸平行地进行成千上万次测序反应，如国际专利申请PCT/US95/12678(WO96/12039)。

不幸的是，“一个碱基一个碱基地”测序方案因存在很多问题而未得到广泛应用，所述问题如阻止在完整的测序操作中测定超过几个核苷酸的任何核苷酸的无效化学。另外，在需要酶促操作的一个碱基一个碱基的测序法中随着自动化进程所用的检测设备会产生其它的问题。当在具有高表面积/体积比率和狭窄的通道尺寸的反应室中进行一系列酶促步骤时，酶可能会粘附在表面成分上，使得洗涤和相继的处理步骤变得非常困难。蛋白质的积累也会影响报道分子系统，尤其是那些利用荧光标记物的系统，从而使基于这种系统的检测结果的解释变得困难和麻烦。这些困难和类似的困难显著阻滞了“一个碱基一个碱基地”测序方案在平行测序努力中的应用。

如果可以利用另一种使利用多种酶的重复处理循环最小化或消除的方法来检测多核苷酸的末端核苷酸，一个碱基一个碱基地测序技术尤其在自动化系统中会取得重要进展。

                    发明概述

因此，本发明的目的是提供不具有目前使用的一个碱基一个碱基的测序方法之缺点的DNA测序方案。

本发明的另一目的是提供能平行地或同时应用于同一反应管中存在的数以千计的DNA片段的DNA测序法。

本发明的另一目的是提供能允许用最少的酶促步骤鉴定靶多核苷酸之末端部分的DNA测序法。

本发明的另一目的是提供一套经编码的衔接子以鉴定一个或多个靶多核苷酸之多个末端核苷酸的序列。

本发明通过提供基于一套或更多套经编码的衔接子与靶多核苷酸的末端(或当用于平行测序操作时为多个靶多核苷酸的末端)连接的核酸分析方法来达到这些和其它目的。每个经编码的衔接子含有突出的链和选自最少交叉杂交套寡核苷酸的寡核苷酸标记物。连接经编码的衔接子，所述衔接子的突出链与靶多核苷酸之互补的突出链形成完全匹配的双螺旋。连接后，通过使经标记的标记物互补物与其在经连接的衔接子上的相应标记物特异性杂交测定或“解码”突出链中的核苷酸和排列次序。