[发明专利]具有葡聚糖酶活性的重组酶

说明书

发明的领域

本发明涉及编码具有葡聚糖酶活性的酶的克隆的DNA序列、包括所说的DNA序列的重组表达载体、丝状真菌宿主细胞、生产所说的重组葡聚糖酶的方法，以及分离并纯化的酶。

本发明还涉及含有重组酶的组合物、口腔保健组合物和产品及在去除齿斑中的应用。

发明的背景

葡聚糖酶是降解葡聚糖分子中α-1,6-糖苷键的α-1,6-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.11)，也称为1,6-α-D-葡聚糖6-葡聚糖水解酶。

已知葡聚糖酶具有多方面的用途，例如作为洁齿剂的成分用于预防龋齿、齿斑和/或牙石，以及用于水解甘蔗和甜菜的粗糖汁或糖浆。

已知有几类微生物能够产生葡聚糖酶，其中包括青霉属、拟青霉属、曲霉属、镰孢属、穗霉属、轮技孢属、长蠕孢属和毛壳霉属的真菌；乳杆菌属、链球菌属、纤维弧菌属、纤维粘菌属、短杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、节杆菌属和黄杆菌属的细菌，以及斯达氏脂肪酵母等酵母。

市售的用来分解粗糖汁的工业用葡聚糖酶是Novo Nordisk公司发酵拟青霉菌生产的葡聚糖酶50L。

下文综述有关葡聚糖酶及其应用的现有文献。现有技术文献

EP663443(Centro de Ingenieria Genetica y Biotechnologia)描述了衍生于Penicillium minioluteum的葡聚糖酶。可在巴斯德毕赤酵母中异源表达该葡聚糖酶。所说的重组酶的最适温度为55℃至60℃,N-糖基化百分比为13至15％,50℃半寿期大约7.6小时。

附图简要说明

图1显示质粒pCaHj483；

图2显示质粒pToC343；

图3显示质粒pToC325；

图4显示重组和野生型淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)葡聚糖酶的pH变化曲线；

图5显示重组和野生型淡紫拟青霉葡聚糖酶的温度变化曲线；

图6显示重组和野生型淡紫拟青霉葡聚糖酶的温度稳定性；

图7显示37℃生长于BHI中的S.mutans、A.viscosus和F.nucleatum的混合培养物的间接Malthus标准曲线；

图8显示表达质粒pJW111，图中标出了SP387启动子和终止子，指示了限制性酶切位点及其在质粒中的相对位置。其中箭头指示bar、β-内酰胺酶(ampR)和葡聚糖酶基因的转录方向。

发明的概要

本发明的目的是提供在丝状真菌宿主细胞中异源产生的淡紫拟青霉的重组葡聚糖酶。

本发明人已首次克隆了编码具有淡紫拟青霉中的葡聚糖酶活性的完整DNA序列，并在丝状真菌宿主细胞中异源产生了该葡聚糖酶。以前只是在淡紫拟青霉中同源产生了这种酶。因此，根据现有技术，包括具有葡聚糖酶活性的酶产物是与具有其他酶活性的混合物一起产生的。能够在适当的宿主中异源产生重组葡聚糖酶是有利的，因为这样有可能提供单一成分的葡聚糖酶。此外，其有利于以工业规模提供本发明的分离并纯化的酶。

本说明书中，术语“异源”产生是指在不同于原始的供体生物的宿主生物体中表达重组酶。

术语“同源”产生是指由原生物体表达野生型酶。

已将包含于质粒pToc325中编码本发明的葡聚糖酶的SEQ ID No.1的完整DNA序列转化到大肠杆菌DH52菌株中。已将该菌侏保藏在DSM，登记号为DSM10706。下文将对其作进一步地详细描述。

经数据库序列对比检索，发现SEQ ID No:1中所示的DNA序列是新的。发现其与上面提到的于1994年8月22日按布达佩斯条约有关规定保藏于Mycotheque de l’Universite Catholigue de Louvain(MUCL)的Penicillium minioluteum(MUCL No.38929)的最高同源性为59％。EP0663443中公开了后者的DNA和氨基酸序列。

本发明的第一个方面涉及DNA构建物，该构建物包含编码具有葡聚糖酶活性的酶的DNA序列，所说的DNA序列包括：

a)SEQ ID No:1中所示DNA序列，和/或可从大肠杆菌DSM10706中得到的DNA序列的葡聚糖酶编码部分，或者

b)a)中所限定的DNA序列的类似物，该类似物

ⅰ)与SEQ ID No.1中所示的DNA序列和/或可从大肠杆菌DSM10706得到的DNA序列至少有80％同源性，或