[发明专利]曲霉属胆色素原合酶和编码该酶的核酸

说明书

                      发明背景

发明所属技术领域

本发明涉及曲霉属胆色素原合酶和包含编码胆色素原合酶的核酸序列的分离核酸片段。本发明也涉及核酸构建体、载体和包含该核酸序列的宿主细胞以及产生该胆色素原合酶的方法。

相关技术描述

血红素(一种原卟啉Ⅸ和铁的螯合物)用作为血红素蛋白的辅基。原卟啉Ⅸ由为四个甲基、两个乙烯基和两个丙酸基团所取代的卟啉环组成，该卟啉环获得一个铁原子以形成血红素。由甘氨酸和琥珀酰-CoA生物合成血红素包括八个酶促步骤。该途径中的第二种酶是胆色素原合酶(也称为乙酰丙氨酸脱水酶)，该胆色素原合酶催化两个5-乙酰丙氨酸分子的缩合而形成胆色素原。胆色素原合酶在粗糙脉孢菌和酿酒酵母的血红素生物合成途径中是限速酶。

从脱辅基蛋白质到血红素蛋白的转化取决于血红素生物合成途径所提供的血红素的可用性。脱辅基蛋白质形式的血红素蛋白与血红素结合产生活性血红素蛋白。活性血红素蛋白获得一种构象，该构象使血红素蛋白比受蛋白水解作用的脱辅基蛋白质更稳定。如果微生物产生的血红素量远小于产生的脱辅基蛋白质量，那么脱辅基蛋白质将积累并经过蛋白水解降解降低活性血红素蛋白的产率。

为了克服这一问题，Jensen显示：把血红素或者含血红素材料添加至发酵培养基，可导致米曲霉的过氧化物酶产率的大量增加(WO93/19195)。当血红素添加至发酵培养基时，可导致血红素蛋白产率的很大提高，但大规模实行起来却不合适，而且很昂贵、很困难。

得自酿酒酵母的胆色素原合酶基因的克隆与表达已经公开(Labbe-Bois和Labbe,1990,In,Dailey,H.A.，编辑，血红素和叶绿素的生物合成，McGraw-Hill,Inc.，纽约，258页)。

本发明的目的是提供新的胆色素原合酶和编码该酶的基因。

发明概要

本发明涉及得自曲霉属的基本上纯化的胆色素原合酶和包含编码曲霉属胆色素原合酶的核酸序列的分离核酸片段。本发明还提供了核酸构建体、载体和包含本发明的核酸片段的重组宿主细胞以及产生胆色素原合酶的方法。

附图简要描述

图1显示质粒pAJ005-1的限制性酶切图。

图2显示米曲霉胆色素原合酶基因的核苷酸与推定的氨基酸序列(分别见SEQ ID NO:1和2)。有下划线的是CAAT盒，方框里的是TATA盒。用点线标明的是推定的内含子，用虚线标明的是推定的锌指结构域。文库探针用黑色实线标明，圈起来的是活性赖氨酸。

图3显示得自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、人、豌豆、大鼠、菠菜、酵母和米曲霉的胆色素原合酶的推定氨基酸序列(分别见SEQ ID NO:22、20、18、21、19、23、17和2)的对比。

图4显示pAJ023的限制性酶切图。

图5显示质粒pJVi9的构建。

图6显示质粒pJeRS6的限制性酶切图。

图7显示质粒pJRoC50的限制性酶切图。

发明的详细描述

如上所述，本发明涉及得自曲霉菌株的胆色素原合酶，例如得自包括但不限于以下曲霉的菌株的胆色素原合酶：臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉和米曲霉。公众很容易从一些培养物保藏中心获取这些物种的菌株，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、联邦德国微生物保藏中心(DSM)、荷兰真菌菌种保藏中心(CBS)、国际微生物研究所(IMI)、农业研究机构专利培养物保藏中心、北方地区研究中心(NRRL)以及日本大阪发酵研究所(IFO)。

在一优选的实施方案中，本发明涉及得自曲霉的胆色素原合酶。在一更优选的实施方案中，本发明涉及得自米曲霉的胆色素原合酶。在一最优选的实施方案中，本发明涉及得自米曲霉IFO 4177或者其突变体菌株的胆色素原合酶，例如具有SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列的胆色素原合酶。