[发明专利]乙型肝炎病毒前表面抗原蛋白导向药物

说明书

本发明涉及一种基因工程表达的融合蛋白，即将乙型肝炎病毒表面抗原(Pres1-65)与毒素蛋白相连接的融合蛋白。毒素蛋白应选用对患病细胞有针对性作用的，例如人肿瘤坏死因子或其突变体，特别是第二位由Arg突变为Lys的人肿瘤坏死因子突变体。

众所周知，乙肝表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白，由HBV基因组的S开放阅读框架(S-ORF)所编码，HBsAg含有大、中、小3种分子形式蛋白质，这些蛋白质C端具有相同的序列^1、2。其中小分子蛋白(SHBs)即主要蛋白由226个氨基酸组成，中蛋白是在主要蛋白N端加上由55个氨基酸组成的preS₂区，大分子蛋白(LHBs)则根据病毒亚型的不同在中蛋白的N端前面再加上由108或119个氨基酸组成的preS₁区，这三种蛋白都存在糖基化和非糖基化的形式。Lin和Pontisso等实验表明，LHBs的preS₁区参与病毒与肝细胞膜的结合，Petit等指出preS₁(21-47)肽段是病毒与含有肝细胞受体的肝肿瘤细胞HepG₂的结合位点，但也可能还有preS₁(11-14)肽段。Rhyum等认为，HBVadr亚型preS₁(1-56)肽含有B细胞和T细胞抗原决定簇，preS₁蛋白含有许多免疫原性比S蛋白更强的T细胞和B细胞表位，preS₁特异性的细胞免疫可以帮助克服某些个体对S蛋白的免疫无反应状态或同时对S蛋白和preS₂蛋白的双重无反应状态⁹。实验还证明，化学合成的preS₁(12-47)肽段接种黑猩猩后，能使黑猩猩对HBV攻击获得良好保护，因而有人提出基因工程疫苗也应带有preS₁蛋自，以期获得对HBV比较全面均衡的免疫效果。还有人报道，preS₁抗原的出现与病毒的复制水平密切相关，而且乙肝病毒表面抗原上的preS₁表位只有在病毒完全消除之后才会消失，从而可以用作指示病毒复制剂量以及预后和评价治疗效果的检验指标。为此，汪垣等人采用化学合成preS₁(20-47)肽段以及核心抗原与preS₁(20-47)融合表达蛋白，Sidorkieovicz¹⁴等则采用与β半乳糖苷酶(450aa)融合表达得到的preS₁(20-4退)四串联肽段建立了preS₁的抗原-抗体检测试剂盒。

本发明利用乙肝病毒表面抗原preS₁对肝细胞具有专一亲和性和人肿瘤坏死因子具有抗肿瘤活性这两方面的特点，将含有β细胞和T细胞抗原决定簇和肝细胞结合的全部位点在内的preS₁(1-65)肽段(或相关肽段)同人肿瘤坏死因子或其突变体的羧末端进行融合并构建成功同时具有HBV-preS₁抗原活性和抗肿瘤活性的融合蛋白，它将有可能发展成为治疗肝癌的导向药物。

本发明的创新点和意义在于：

1、它为今后在人肿瘤坏死因子及其突变体的羧末端接上一个具有与肿瘤细胞特异抗原有高亲和性的肽段进行融合，构建成功对某种肿瘤细胞具有高效的新的抗肿瘤药物提示了可能性。

2、它开创了乙肝病毒表面抗原PreS₁与其它毒素或杀伤蛋白以融合的方式来构建对肝区疾病有特异性疗效的导向药物的方向。

3、提供了一条制备乙肝病毒preS₁抗原肽段的新方法。

本发明的优点是：

1、避免了毒素蛋白可能引起的脏器中毒或全身性副反应。

2、排除了其他脏器对药物的反应，在剂量设置时只需单纯考虑药物对肝细胞的作用，有利于准确给药。

3、减少用药量

下面结合附图对本发明作一步说明：

图1是P₁、P₂、P₃、P₄引物顺序表

图2是preS₁(1-65)肽基因序列图

图3是肿瘤坏死因子(h-TNFα)基因序列图

图4是hTNFα-PreS₁融合基因序列图