[发明专利]鹿茸细胞的工业化生产方法

说明书

本发明涉及细胞株的人工培养方法，具体地讲涉及鹿茸细胞的工业化大规模生产方法。

鹿茸细胞是自然界中一种特殊的哺乳动物细胞，在鹿体上正常分裂生长速度超过癌细胞。我国人民发现鹿茸药用已有悠久历史，临床疗效，保健作用卓著。现代医学研究确证了鹿茸的活性物质和药理机制，国内外倍受推崇。

鹿茸生产自有始以来均依赖于野生猎取或以人工家养方式获得鹿茸，受自然界和养殖条件束缚，质量优劣悬殊，生产水平有限。

本发明的目的在于寻找一种大规模工业化生产鹿茸细胞的方法，该方法操作简便，成本低，并且产品应该具有天然鹿茸的相同药理作用，

本发明人经过几十年反复试验，多次选择，逐渐摸索出了一种鹿茸细胞的转瓶工业生产方法，该方法采取鹿茸生长点的组织为原始材料，于特定的细胞生长培养液中连续传代培养获得适于大规模转瓶生产的种细胞株。本发明以生物工程转瓶工业化生产鹿茸细胞，独创了鹿茸物质生产新方式，使其产品完全达到“腊片”水平，经济开发源力深远。

本发明的目的是这样实现的：

一、原始母细胞株的培养

从幼嫩鹿茸生长点采取生茸细胞原始材料，特征为棱形，圆形不同分化阶段的异形细胞，在无菌操作条件下，将原始材料排列于细胞培养瓶中，做贴壁培养，加少量(十分之一容量)细胞生长液，生长液(一)：配方

Eagle氏最低要素营养液(E-MEM)    78％

新生犊牛血清                    20％

卡那霉素                        1％

碳酸氢钠                        1％

于34℃培养，从鹿茸组织周边外延生长细胞，细胞形态不一，根据生长适应情况不断更换生长液，先倾出原培养液，添加新生长液，待长出单层，弃去原始组织，分散细胞，从原代细胞做次代接种培养，细胞生长分裂增殖良好，以0．25％胰酶液消化分散细胞做连续传代培养，根据细胞数量逐步分瓶扩大，并向较大培养瓶过度，温度由34℃升高至37℃。当传代达20代左右出现滞生现象，生长缓慢，细胞分裂现象不够旺盛，有终止传代危险，要采限促生措施，使用生长液(二)，使细胞延续传代达到30代。

细胞生长液(二)配方：

E-MEM           90％

新生犊牛血清    7％

细胞生长促进物(鹿血浆鹿肝浸出液2％

                1∶10 Eagle液)

卡那霉素        1％

碳酸氢钠        调PH7．0-7．2

二、种细胞株的培养

将上述获得的传代30代的鹿茸母细胞株接种于装有十分之一量生长液(一)的培养转瓶中，转瓶容量为3升，生长温度调节至34-37℃，培养旋转数为6-30转／小时，培养时间为3-7天，然后做次代接种培养，培养条件相同，连续传代30-150代，达到生长周期一致，长势旺盛，生命力强，得到理想的种细胞株，该细胞株已于1997年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No．0308，可将该细胞株直接用于生产或于-75℃～-195℃超低温保存备用。

三、鹿茸细胞转瓶工业化生产

采用3升、10升或15升培养转瓶，加入十分之一容量的细胞生长液(一)，取种细胞株接种，接种量约为20万／ml，在34-37℃恒温下，每5-8分钟旋转-周(每小时8-12转)，培养24-72小时完成分裂增殖，每毫升可获得细胞10⁶以上，每台体积2．7-3．00M³转机生产13，500毫升细胞液，在2000M²配备24台转机的生产车间可年产15，500立升鹿茸细胞。

四、鹿茸细胞的活性、药理作用

活性分析证实：含有临床疗效相对应的基础物，主要有18种以上氨基酸，其中有7种人体必需氨基酸，2种半必需氨基酸：含有磷脂、多肽、尤其是含有次磺嘌呤以及精脒，精胺等多胺物质。

药理试验证：鹿茸细胞具有显著的抗疲劳和抗衰老作用，能促进核酸(RNA)和蛋白质合成，有抑制单胺氧化酶活性作用，抗氧化作用以及雄性激素样作用。

药理作用、药用功效，活性物质均与天然鹿茸相一致。