[发明专利]丙型肝炎病毒复合多价疫苗基因的合成与克隆

说明书

本研究属于分子生物学领域。

丙型肝炎是目前国际上研究的热点之一。自1988年非甲非乙型肝炎病毒被命名为丙型肝炎病毒，有关丙肝的病理、诊断、治疗、预防以及丙肝病毒的分子生物学方面的研究迅速开展起来，并取得了一系列突飞猛进的进展。在一些国家，目前丙型肝炎的感染率较高，但却无确实可行的治疗手段，因此丙肝疫苗的研究为丙型肝炎的防治带来了希望。

约80％的非甲非乙型肝炎为丙型肝炎病毒(HCV)所致，其中又有60％丙型肝炎呈慢性化，且容易发生肝硬化，并与肝细胞癌关系密切，可见HCV危害很大。丙型肝炎病毒为单股正链RNA病毒，由约9400个核苷酸组成，外披包膜，脂质含量高。分类学上HCV属披膜病毒科中的黄病毒属，基因结构与黄病毒、瘟疫病毒相似。从进化上分析，HCV可能为一类重组病毒，其C′端氨基酸源于披膜病毒甲科，N端来自小核糖核酸病毒科。HCV整个基因组只有一个ORF，编码一条3010、3011或3033个氨基酸残基的蛋白前体，病毒多肽就起始于它的第一个蛋氨酸。ORF内从5′端起依次为C区(核心)、E1区(衣壳)、非结构蛋白区(NS)按5′-3′并列者NS1-NS5五个基因。NS1又称E2区或E2/NS1区，该区N端存在由25或30个氨基酸组成的超变区(HVR)。长期以来，对HCV的治疗一直没有理想的办法，因此丙型肝炎疫苗的研制就显得十分重要，但由于多种因素的制约，HCV疫苗的研制现还没有突性的进展。

自1988年Houghton等首次分离并克隆了HCV的部分序列后，人们对HCV才有了更深入的了解。1991年， Farci等希望通过完整的HCV病毒免疫来获得特异性保护，但结果提示该方法不能提供对HCV有效的保护力(Farci P et al。Hepatitis，1991；14：90A)。Spaete等在CHO细胞中表达了E2/NS1蛋白，并与一种佐剂免疫7只大猩猩，再用HCV株攻击，其中有2只获得保护，而对照组则全部感染了HCV，提示该蛋白可能是免疫应答的一种靶部位，可作为HCV疫苗的候选抗原(Richard RS et al。Virology，1992；188：819)。随后，Choo等用重组痘苗病毒表达了HCV的E1及E2蛋白，并把这两种蛋白分别免疫7只黑猩猩，结果其中5只产生了抗HCV-E抗体的滴度超过1∶15000，且对同株HCV的攻击具有良好的保护性，另两只滴度较低，短暂感染上HCV，提示所产生的抗HCV-E抗体可能为中和抗体，但是否具有交叉保护性或长期免疫力等还需继续观察(Choo QL et al。Proc Natl Acad Sci USA，1994；91：1294)。

在中国，HCV疫苗的研究则主要采用PCR技术，获得目的基因后进行表达及免疫原性的研究。中国已先后有人进行了HCV重组蛋白的初步尝试。北京中国药品生物制品检定所的张庶民等用融合蛋白表达质粒pGex，在大肠杆菌中表达了HCV核心区不同基因片段，用免疫印染和ELISA证明了HCV核心蛋白的抗原性。同所的祁自柏等也在大肠杆菌中表达了HCV的部分非结构NS4基因，并在国内首次用DNA重组法表达了HCV部分NS4-NS5基因，经分子杂交分析，表达产物可特异地与抗HCV非结构区抗体反应。第三军医大学附属西南医院传染病专科中心沈定霞等将HCV外膜E2/NS1基因克隆至融合型表达载体，在大肠杆菌中进行表达，表达的重组蛋白经Western Blot和ELISA鉴定具有HCV外膜蛋白的抗原性，能与丙肝病毒感染血清发生特异性结合反应，为研究外膜蛋白抗体的意义创造了条件。由于HCV包膜糖蛋白的基因结构及疏水图谱与黄病毒、瘟病毒的包膜蛋白非常相似，而黄病毒NS1蛋白和瘟病毒gp53/gp55已证实可刺激机体产生中和抗体，保护机体不受病毒致死性攻击的作用。

但采用PCR技术获得目的表达产物的手段，对迅速变异的HCV则可能无法提供有效的保护，其主要问题在于：

(1)HCV高度变异：与HBV不同的是，HCV病毒株极易变异，现已在世界各地测定了数十株HCV全基因序列和更多的HCV RNA克隆片段。HCV核酸和氨基酸高度易变，核酸序列的同源性仅60％-92％，因此HCV存在有许多不同的型和亚型。一般认为一种病毒不同病毒体之间核酸序列的同源性如小于80％则分属不同的基因型。依此原则，目前世界各地克隆的HCV毒株大致分为4个主要基因型(HCV I，II，III，IV)，各型间的氨基酸及核苷酸组成相似性小于80％，且几乎很难见到两个完全相同的克隆。