[发明专利]两性蛋白质转染药物试剂的制备方法

说明书

所属技术领域：两性蛋白质转染药物试剂---广谱性及靶向性试剂制备技术属生物技术领域。

现有技术：进入90年代，随着分子改造技术、分子修饰研究的发展，促进了脂质体转染技术的兴起，给基因工程、分子药理学以及细胞模型的建立拓宽了视野，带来了方便。基因枪及脂质体转染试剂相继于80年代中期开始相继被应用于分子生物学、分子药理学、细胞的分子生物学及基因工程的研究领域。

但是，以蛋白质为原料的转染试剂至今尚未问世，截止到1993年8月22日从世界专利数据库WPI及CA检索中尚未发现有人用天然蛋白质为原料制备分子微胶囊技术，更谈不上用蛋白质载体制备载药转染试剂给不同类型细胞进行药物导入的研究。本方法所涉及的载体原料以及制成的转染试剂说明分子生物学、细胞生物学及分子药理学之间的学科界限将随着试剂的问世而逐渐淡漠或消失融为一体，对于学科改造将是一个大的突破。

1993年6月被推向市场的多阳离子转染试剂(Lipofectamine)只以广谱、高效、使用简便为优势进行宣传。而本发明涉及的技术具广谱性、使用简便及高效外，独特的靶向性转染是该技术的另一特性之一，渴望该技术将为肿瘤等疑难病症的疹断和治疗提供一个有用的桥梁。

靶向性转染药物试剂的含意是：在制备转染药物试剂的载体时，由于特异性抗体的参与使载体囊壁表面蛋白与之结合交联成具有一定趋向性的功能性转染试剂。趋向的特性完全由抗体的特异性决定。如载体挂上抗肝癌抗体，则靶向性转染试剂即趋向于肝癌细胞而不是一般正常的肝细胞。称该趋向性转染即定向地将药物导入于指令细胞的转染试剂称为靶向性载药转染试剂。被导入药物的细胞如用“中弹靶子”即被治疗和被杀伤的细胞，而载药的该靶向性转染试剂即成为“分子导弹”了。

本发明的特点：从中国小麦麦粉中纯化出的两性蛋白质除可做为无毒载体外尚可将药物导入细胞，在制备工艺上比目前市场上脂质体转染试剂简便，使用亦方便价格亦低廉转染率高。尤其是靶向性导向转染试剂的制备工艺更是脂质体转染试剂所不及。又由于在该蛋白质分子组成中富有40％以上的疏水氨基酸残基，大大助于由其组成的载体与细胞膜的结合机会，无序的线头状蛋白复合体所组成的载体的囊壁比有序的分子排列整齐的脂质体双层膜更易于在载体与细胞亲合过程中将载体的药液导入细胞完成药物转染过程。

优点及效果：

生物技术一直为人们开发利用和造福于人类，当今DNA重组或称基因工程已被公认为20世纪生物学中一项伟大的成就，也是目前新技术革命的重要组成部分。基因工程应用于农业科学研究，促进了绿色革命；应用于医学，开拓了生物治疗、基因治疗的前景。

基因工程：就是通过一系列步骤而实现的，将来自不同生物的基因同有自我复制能力的载体DNA，通过某种分式连接，再构建成新的重组DNA，并通过受体细胞进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合的一门新的技术称为基因工程技术或成基因工程。

该技术的完成是极其复杂的过程，包括对目的基因的取得、载体的选择、酶的筛选和合理运用、重组体构建、转化的鉴定以及目的基因在受体细胞中的表达等步骤，而且受诸多因素和条件的限制，其中外源DNA分子导入某一种宿主细胞的过程称转化(transfomation)或称转染(transfection)无论用于植物细菌细胞或是哺乳动物细胞常用的方法不外下述几种。

最常用的方法是磷酸钙和DEAE-葡聚糖介导的转染，目前认为转染DNA是通过内吞作用进入细胞的，葡聚糖介导可能因聚合物的毒性对某些细胞转化带来困难。其次原生质体融合是对于DNA内吞效率不高的细胞中更为有效，亦有用PEG1000-8000促进原生质体膜通透性的变化导致DNA进入细胞；第三种方法聚季铵盐法被认为是可以把低分子量的DNA有效而稳定地导入难以转染的细胞系的一种方法。第四种和第五种是细胞核直接进行显微注射法和利用基因枪进行电穿孔法；第六种即利用人工膜泡作为运送载体作为转染DNA的工具1993年6月被推向市场的多阳离子转染试剂便是以脂类为原料通过脂质体包囊DNA通过脂质体与被转染细胞的细胞膜的融合实现转染内容的全过程。

但是，无论采用那种方法将DNA导人细胞，瞬时或是稳定转染，其转染效率在很大程度上取决于可用细胞的类型，经验证明不同的培养细胞系摄取和表达外源DNA的能力有时可相差几个数量级。

本发明涉及的两性蛋白质转染试剂：

①其纯属为天然蛋白质，对于培养细胞进行5小时以上的长时间的转染未见其出现细胞毒性。(通过胎盘兰染色证明)